Разделенный по двум векторам терапевтический ген можно «сшить» обратно с помощью рибозима

Генная терапия с применением аденоассоциированных вирусных векторов перспективна для лечения генетических заболеваний, однако размер генов, которые можно доставить с помощью AAV, ограничен. Авторы публикации в Science разработали технологию, которая позволяет из отдельных фрагментов восстановить терапевтическую мРНК — ее фрагменты кодируются двумя независимыми AAV-векторами.

Технология основана на рибозимах — небольших РНК с каталитической активностью. При расщеплении ими РНК образуются 2′,3′-фосфатные и 5′-гидроксильные концы распознаются одним из компонентов репарации РНК — лигазой RtcB, которая сшивает такие концы друг с другом. Исследователи из США решили проверить, можно ли с помощью рибозимов проводить бесшовное транслигирование мРНК в клетках млекопитающих. Для этого репортерный ген GFP разбили на два фрагмента — каждый в составе своей плазмиды вместе с последовательностью, кодирующей рибозим. Коэкспрессия фрагментов самих по себе не приводила к накоплению GFP в клетке, но при наличии рибозимов трансфицированные клетки начинали флуоресцировать. ПЦР с обратной транскрипцией подтвердила, что транслигирование фрагментов мРНК прошло по предсказанному сайту разрезания рибозимов.

Усилить экспрессию целевого белка позволило внедрение в последовательность интрона — его фрагменты разместили между последовательностью рибозима и целевым участком. Сплайсинг в таком случае удалял остатки рибозимной последовательности, если они сохранялись, например, при использовании других рибозимов.

Технология получила название StitchR. Авторы работы показали, что с ее помощью можно восстановить утраченную экспрессию эндогенного белка. Они нокаутировали в клетках HeLa ген гладкомышечного актина, а затем коэкспрессировали в нем пару плазмид StitchR, кодирующих половины этого гена. В результате гладкомышечный актин экспрессировался с нормальной локализацией, которую подтвердили с помощью иммунофлуоресцентного анализа.

Емкость аденоассоциированного вирусного вектора составляет около 4,7 килобаз — это ограничивает возможности генной терапии с применением AAV. Ученые клонировали StitchR с GFP в векторы, на основе которых затем собрали вирусные частицы серотипа AAV1. Трансдукция таким вирусом клеток HEK293T обеспечивала устойчивую флуоресценцию. С помощью секвенирования тотальной РНК авторы подтвердили лигирование исходных фрагментов.

Эффективность метода далее проверили in vivo. Десятидневным мышатам внутрибрюшинно вводили аденовирусные векторы, кодирующие фрагменты GFP. Флуоресцентная визуализация, проведенная через пять месяцев, выявила экспрессию GFP по всему телу мыши.

Мутации с потерей функции в дисферлине, крупном мембранном белке массой 237 кДа, приводят к трем основным фенотипам мышечной дистрофии. Авторы получили пару векторов StitchR для экспрессии полноразмерного человеческого дисферлина (6 240 нуклеотидов). В составе AAV9 — вирусов с мышечным тропизмом — их вводили мышам с нокаутом дисферлина. Через месяц после инъекции иммунофлуоресцентное окрашивание выявило экспрессию этого белка в скелетной мускулатуре и в сердце, причем локализовался он на мембранах.

Ген дистрофина — еще одного белка, мутации в котором связаны с мышечной дистрофией Дюшенна, — превышает емкость двух AAV. В пару векторов StitchR клонировали усеченный вариант, для которого уже подтверждена функциональность. В клеточной модели уровень экспрессии дистрофина достигал 94,8% относительно варианта, кодируемого единственным вектором.

У мышей, нокаутных по дистрофину, с возрастом прогрессирует дегенерация мышечных волокон. Восьмидневным мышам вводили StitchR, кодирующий усеченный дистрофин в миотропном AAV9. Через месяц после инъекции их мышечная архитектура соответствовала дикому типу, тогда как у контрольных нокаутных мышей, получавших физраствор вместо StitchR, происходила дегенерация миоволокон. Иммунофлуоресцентное окрашивание мышечной ткани выявило нормальную мембранную локализацию усеченного дистрофина у животных, получавших инъекцию. Белок экспрессировался в скелетной мускулатуре и сердце — уровень экспрессии достигал 94,9% от эндогенного в четырехглавой, 41,9% в передней большеберцовой, и 75% в сердечной мышцах. Маркеры мышечного повреждения вернулись к нормальному уровню.

Предложенный подход с использованием транслигирования мРНК позволил восстановить экспрессию крупных белков in vivo, препятствуя тем самым развитию патологии. При этом экспрессия возвращалась к нормальному эндогенному уровню — такая способность StitchR может обеспечить методике преимущество перед терапевтическим применением двойных AAV.

Рибозим со свойствами РНК-полимеразы синтезировал функциональные молекулы РНК