Разработан новый экспресс-тест, основанный на узнавании S-белка коронавируса гликанами

Исследователи из Уорикского университета и компании Iceni Diagnostics в сотрудничестве с коллегами из университетских больниц Ковентри и Уорикшира разработали диагностическую экспресс-систему для детекции SARS-CoV-2. В качестве основного реагента используется α,N-ацетилнейраминовая кислота (Neu5Nac). Система показала хорошие результаты на псевдотипированных вирусных частицах и назальных образцах COVID-положительных пациентов, а также высокую устойчивость ко внешним факторам.

С началом пандемии COVID-19 было создано множество тестов для диагностики SARS-CoV-2. Изначально тесты создавались на основе ОТ-ПЦР, и этот метод по-прежнему остается наиболее надежным и точным инструментом диагностики. Но, как показывает практика, результаты ОТ-ПЦР часто становятся известны только через несколько дней. Поэтому есть необходимость в быстрых и недорогих методах, подходящих для массового тестирования и скрининга, ведь основное средство борьбы с пандемией — это своевременное выявление носителей инфекции и их изоляция, а быстрая диагностика позволяет начать лечение на ранних стадиях.

За почти два года было создано множество вариантов быстрых диагностических тестов, на основе как молекулярно-генетических технологий (LAMP, EXPAR, CRISPR), так и иммунохроматографических методов с использованием тест-полосок (LFD, lateral flow device). Последний вариант отличается относительно небольшой себестоимостью, скоростью выдачи результата (в пределах получаса) и удобством для массового применения в местах оказания медицинской помощи, поскольку не требует сложного и громоздкого оборудования.

В настоящее время существует несколько вариантов диагностических тестов на COVID-19, выявляющих присутствие в назальных пробах нуклеокапсидного (N) белка SARS-CoV-2, которые используют для детекции антитела. Эти тесты менее чувствительны, чем ОТ-ПЦР, но обладают высокой специфичностью.

Однако в тест-системах в качестве агентов, связывающих искомую молекулу, можно применять не только антитела. В новой работе авторы предлагают использовать гликаны, которые являются мишенью для проникновения в клетку у многих вирусов. Гликаны удобны тем, что их можно химически синтезировать в больших количествах. Ранее авторы обнаружили, что S1-домен S-белка SARS-CoV-2 связывается с гликаном Neu5Nac. В других работах было показано, что сиаловые кислоты (к которым относится Neu5Nac) могут быть рецепторами для S-белка, а гликаны участвуют в связывании SARS-CoV-2 c рецептором ACE2.

Авторы создали тест-полоску, в которой для выявления SARS-CoV-2 используются молекулы Neu5Nac, конъюгированные с наночастицами золота. В отличие от традиционных иммунохроматографических тестов здесь не применяется сэндвич-система. Образец напрямую сорбируется на нитроцеллюлозную мембрану и высушивается. Наночастицы конъюгата Neu5Nac c золотом, синтезированные с помощью технологии RAFT, напыляются на мембрану. После подачи буфера частицы мигрируют к точке нанесения образца и далее к контрольной линии. На контрольной линии иммобилизованы лектины, напрямую связывающиеся с наночастицами. После этого образовавшиеся комплексы окрашиваются серебром.

 Baker A., et al | DOI: 10.1021/acssensors.1c01470

Тест-полоски оказались достаточно устойчивыми к воздействию атмосферы (21 день в комнате без контроля режима температуры и влажности) и высокой температуры (12 часов при 70°C). Хотя тесты, подвергнутые экстремальному воздействию, и показывали пониженную чувствительность, они все равно имели преимущество перед иммунохроматографическими тестами, которые в подобных условиях не работали.

Тест показал удовлетворительные результаты на образцах псевдотипированного лентивируса с S-белками SARS-CoV-2 на оболочке, на нативных псевдовирусных частицах и на частицах, инактивированных нагреванием. Затем тест-системы были протестированы на панели термически обработанных образцов назальных смывов пациентов с известными результатами ПЦР-тестов. На всех положительных образцах были получены положительные результаты. Эти образцы также использовали для оптимизации метода окрашивания серебром. Дополнительно тест-системы проверили на псевдовирусных частицах с S-белками штаммов B.1.1.7, B.1.351 и P1.

Для оценки кросс-реактивности использовали гемагглютинины из разных вирусах гриппа (H1N1, H3N2, H7N8 и H7N3), а также вирионы гриппа, инактивированные β-пропиолактоном. Кросс-реактивность была показана только для гемагглютининов H3N2, но инактивированные вирионы этого же типа такого ответа не давали. Вероятно, это объясняется различием в концентрации гемагглютинина на поверхности вируса и чистого белка при нанесении на мембрану.

«Эта работа показывает потенциал использования гликанов в качестве альтернативных реагентов для детекции по сравнению с традиционными методами на основе антител», –– говорит Мэтью Гибсон, профессор медицинской школы Уорика и кафедры химии университета Уорика. –– «Кроме того, использование наших полимерных линкеров, которые позволяют нам представить гликан на наночастицах (которые образуют красную линию), демонстрирует преимущества настоящего междисциплинарного межсекторального сотрудничества. Эта работа показывает, что наш подход может работать с первичными клиническими образцами, и мы вместе с нашими партнерами активно развиваем его в реальном устройстве».