Редактирование геномов бактерий с помощью ретронов позволяет изучать связь генотипа и фенотипа

Исследователи из США и Великобритании создали высокопроизводительный метод внесения точечных мутаций в бактериальный геном для последующего изучения фенотипа. Они использовали ретроны — ретроэлементы прокариот, которые производят многокопийную однонитевую ДНК. В эту ДНК вносят желаемую мутацию и два гомологичных таргетной последовательности участка, после чего она участвует в рекомбинации с таргетным локусом генома. По мнению авторов, метод можно будет адаптировать и для геномов эукариот.

Credit
Jarun Ontakrai | 123rf.com

В современной биологии очень важное место занимает редактирование геномов и наблюдение за полученными фенотипами. Большинство высокопроизводительных методов работают с достаточно большими участками генома — целыми генами или регуляторными последовательностями. Ученые из США и Великобритании разработали высокопроизводительный метод, который позволяет вносить и отслеживать точечные мутации в геноме бактерий.

Новый метод, который назвали Retron Library Recombineering (RLR), использует бактериальные ретроэлементы — ретроны. В прокариотической клетке они подвергаются обратной транскрипции, производя многокопийную однонитевую ДНК (single-stranded multi-copy satellite DNA, msDNA). Предыдущие работы показали, что msDNA может быть донором рекомбинации и инструментом для редактирования генома. Для этого в msDNA вносится мутация, окруженная гомологичными последовательностями к таргетному локусу. Авторы исследования работали над повышением эффективности метода.

Ученые сконструировали плазмиду с ретроном. Ее последовательность включала гены устойчивости к антибиотикам и Redβ — single-stranded annealing protein (SSAP), который участвует в рекомбинации. Плазмиду вводили в бактерию Escherichia coli. Изначально только около 0,1% клеток с плазмидой имели желаемую мутацию в геноме.

Для повышения эффективности редактирования генома в бактериях инактивировали систему репарации ошибочно спаренных нуклеотидов и экзонуклеазы. Также увеличили время редактирования. При замене Redβ на CspRecT появилась возможность вернуть активность системы репарации ошибочно спаренных нуклеотидов. Эффективность рекомбинации при таких условиях составляла 65–89%, в среднем 76%.

Исследователи вносили в геном штамма E. coli без системы репарации ошибочно спаренных нуклеотидов и без экзонуклеаз мутации, обеспечивающие устойчивость к рифампицину и другим антибиотикам, а также нейтральные, вредоносные и летальные мутации. Бактерии выращивали на рифампицине. После селекции секвенирование ретронов позволило корректно идентифицировать мутации, придающие устойчивость к рифампицину.

С помощью метода RLR можно также определять мутации, вызвавшие тот или иной фенотип, например, устойчивость к антибиотикам. Геномную ДНК штамма E. coli, устойчивого к триметоприму, разделили на фрагменты. После чего к ним лигировали адаптеры и использовали для создания RLR-библиотеки. Библиотеку вносили в штамм E. coli без системы репарации ошибочно спаренных нуклеотидов и без экзонуклеаз. Бактерии выращивали на триметоприме. В результате идентифицировали два SNP в локусе folA, который кодирует белок — цель воздействия триметоприма. Один SNP, скорее всего, увеличивает уровень транскрипции белка, а второй улучшает его каталитическую активность — известные пути развития резистентности к антибиотику.

В дальнейшем авторы исследования планируют использовать другие методы скрининга, не только отсутствие роста бактерий, а также разработать RLR для других организмов, потенциально и для эукариотических.

Источник:

Schubert M.G., et al. // High-throughput functional variant screens via in vivo production of single-stranded DNA // PNAS, 118 (18) e2018181118, published May 4, 2021, DOI: 10.1073/pnas.2018181118

Добавить в избранное

Вам будет интересно