Редактирование оснований in vivo позволило выжить мышам, зараженным прионами

Прионы вызывают у человека смертельно опасные заболевания. Методов их лечения пока не существует, однако возможным подходом считается снижение экспрессии белка PrP. Ученые из США предложили редактировать основания in vivo в гене этого белка и проверили способ на мышах, зараженных патогенной формой человеческих прионных белков. Продолжительность жизни мышей, получавших лечение, возрастала примерно на 50%.

Изображение:
Структура человеческого PrP.
Credit:
123rf.com

Прионные болезни — группа неизлечимых нейродегенеративных заболеваний с летальным исходом, возникающих из-за неправильного сворачивания и накопления белка PrP в нейронах. К ним относятся болезнь Крейтцфельдта-Якоба (CJD), болезнь Герстманна-Штраусслера-Шейнкера, фатальная семейная бессонница и др. Одобренной для использования на людях терапии пока не существуют, однако в настоящий момент проходят клинические испытания антисмыслового нуклеотида для снижения уровня белка. Опубликованная в Nature Medicine статья посвящена исследованию нокдауна PrP с помощью редактирования оснований in vivoее авторы подтвердили перспективность метода на мышиной модели.

Неправильно свернутый PrP вызывает прионную болезнь через токсическое усиление функции: приблизительно в 85% случаев причиной служит спонтанный мисфолдинг, еще в 15% — белок-кодирующие мутации в гене PRNP, и менее в 1% — инфекция. Одной из возможных стратегий лечения прионных болезней может быть удаление PrP из клеток. Доказано, что его функция связана с поддержанием миелина на периферических нервах, однако уменьшение его количества или полное удаление все еще совместимо со здоровой жизнью. Мыши с гомозиготным нокаутом Prnp (ген, кодирующий PrP) устойчивы к прионным болезням, а гетерозиготные демонстрируют сниженную восприимчивость к ним. Несмотря на то что неизвестно о существовании людей с нуль-мутацией PRNP в гомозиготе, ее гетерозиготные носители живут полноценной жизнью и встречаются с частотой около 1 на 18 000.

Команда ученых из США разработала стратегию точечного нокдауна PrP на мышиной модели с использованием редактирования оснований in vivo. Цитозиновые и адениновые основания доставлялись в клетки головного мозга мышей с помощью аденоассоциированных вирусов для постоянной модификации локуса PRNP.

Цитозиновые редакторы оснований (CBE) превращают C•G в T•A, что позволяет преобразовывать кодоны аргинина, глутамина или триптофана в стоп-кодоны. Исследователи сконструировали 13 одиночных гидовых РНК для SpCas9, которые определяют область редактирования оснований для получения преждевременного стоп-кодона в PRNP. В качестве мишени выбрали N-концевую область, поскольку известно, что некоторые усеченные по С-концу варианты усиливают патогенную функцию. Клетки HEK293T трансфицировали плазмидами, кодирующими гидовую РНК, редактор оснований BE4max, никазу SpCas9(D10A) и две копии ингибитора ДНК-гликозилазы урацила (UGI). Редактирование оснований в такой системе оказалось направлено на Trp57, Arg37, Gln83 и Trp81 со средней эффективностью редактирования 57%, 54%, 52% и 52%, соответственно. Исследователями выбрали из этих вариантов замену аргинина (R37X), поскольку она встречается у человека — отсюда можно предположить, что этот вариант не является патогенным.

Для оценки снижения уровня клеточного PrP трансфицированные клетки инкубировали с антителом против PrP, конъюгированным с флуорофором. Проточный цитометрический анализ показал снижение средней интенсивности флуоресценции на 43% в обработанных клетках по сравнению с контролем. Уровень оказался сопоставим с нокдауном PrP при помощи CRISPR-Cas9 (53%), но чистота продуктов редактирования была выше.

В организм модельных мышей авторы доставили редактор оснований и гидовые РНК с помощью аденоассоциированных вирусов. Для начала исследователи сравнили два подхода введения вирусного вектора — они показали, что системное введение позволяет достичь обширного редактирования клеток мозга. Дальнейшую оценку проводили на линии мышей, несущих три копии человеческого PRNP дикого типа, — в их организме экспрессируется соответствующий уровень PrP человека. Мышам вводили вирусы в общей дозе 1 × 1014 вирусных геномов (vg) на кг, а спустя сто дней проводили биопсию мозга. Выяснилось, что 20% всех аллелей PRNP содержали целевую замену кодона, и это сопровождалось снижением уровня PrP на 31%.

В следующем эксперименте мышам в возрасте 6–9 недель вводили вирусные конструкции: в группу лечения, получавшую функциональную систему редактирования, включили 21 мышь, в контрольную 16. Через неделю им вводили патогенные изоляты человеческих прионов — sCJD MM1, вызывающий наиболее распространенную форму спорадической прионной болезни, и E200K, экспрессирующийся при генетической форме. По соображениям биобезопасности из животных, инокулированных прионами, не извлекали ткани головного мозга. Поэтому авторы сохранили небольшую когорту, которая получила лечение, но не подвергалась воздействию прионов.

За всеми группами наблюдали в течение 600 дней. Средняя продолжительность жизни мышей, инокулированных патогенным прионом человека, была выше в случае, если помимо прионов они получали редактор оснований. В когорте sCJD MM1 разница составила минимум 59%, причем два получавших редактор оснований животных были живы в конце исследования, в то время как ни одно из контрольных не выжило. В когорте E200K мыши, которых «лечили» редактором оснований, пережили контрольных на 44%. Усредненная разница продолжительности жизни, таким образом, составила 52%. У контрольных мышей, зараженных прионами, резко снижалась масса тела и менялись поведенческие характеристики — этого не происходило у мышей, получавших помимо приона редакторы основания.

На 600-м дне жизни неинокулированную когорту собрали для оценки эффективности редактирования и уровня белка PrP. В клетках мозга мышей, получивших лечение, 37% PRNP содержало замену R37X, а уровень экспрессии снижался на 42%.

Далее исследовательская группа предприняла попытку оптимизировать стратегии редактирования, чтобы добиться аналогичного или лучшего снижения PrP при более низких вирусных дозах (а также для снижения нецелевой экспрессии редакторов оснований в других тканях). Ученые протестировали три усовершенствованных оснований в клетках HEK293T. Эффективность редактирования возросла на 61-76%. Затем мыши, экспрессирующие PRNP человека, получили вирусы в уменьшенной дозе — 1,5 × 1013 вг/кг. Через пять недель была взята биопсия мозга. Один из редакторов — TadCBEd32 — показал повышенную эффективность редактирования даже в сниженной дозе. Проведенный через сто дней анализ выявил, что эффективность также росла со временем. Уровень PrP в мозге мышей был снижен в среднем на 63%. Внецелевых редактирований, имеющих предполагаемое клиническое значение, обнаружено не было. Анализ, проведенный на клетках человека, показал схожие результаты.

Таким образом, ученые экспериментально подтвердили потенциал редактирования оснований in vivo для лечения прионных заболеваний. В будущем команда планирует снизить количество вирусных векторных конструкций, исходя из того, что их производство может быть дорогостоящим. Также планируется разработка стратегии, использующей праймированное редактирование для внесения защитной мутации, которая не останавливает синтез белка, а скорее гарантирует, что он не окажется патогенным.


Антисмысловые олигонуклеотиды защищают мозг мышей с прионной болезнью

Источник

An, M. et al. In vivo base editing extends lifespan of a humanized mouse model of prion disease // Nature Medicine (2025), Published Online 14 January, 2025. DOI: 10.1038/s41591-024-03466-w
Добавить в избранное