Сенесцентные клетки помогают гидрактинии регенерировать

Современным животным приходится «выбирать» между стабильным сложно устроенным организмом и высоким регенеративным потенциалом. При этом механизмы пластичности клеток, которые лежат в основе регенерации, далеко не полностью изучены. Важную роль в их исследовании играют представители стрекающих, в частности, морской гидроидный полип Hydractinia symbiolongicarpus.

Гидрактиния похожа на пресноводную гидру в том числе способностью к регенерации. Она может восстановить все тело из небольшого фрагмента за счет плюрипотентных мигрирующих стволовых клеток (также интерстициальных, или i-клеток), расположенных в нижней части тела полипа. Однако теперь выяснилось, что H. symbiolongicarpus способна полностью регенерировать, даже если от нее остался только небольшой фрагмент ротовой области (гипостом), где исходно нет стволовых клеток. В механизмах этого процесса и роли клеточного старения (сенесценции) в регенерации полипа разобрались авторы статьи в Cell Reports.

Ученые убедились, что в гипостоме гидрактинии исходно нет i-клеток, маркером которых был Piwi1 — ген одного из регуляторных РНК-связывающих белков, участвующих в дифференцировке клеток у многих организмов. Однако после начала регенерации фрагмент полипа уже содержал Piwi1-позитивные клетки. Такие i-клетки авторы обозначили как вторичные.

Ученые визуализировали процесс появления новых стволовых клеток у гидрактинии in vivo с помощью трансгенных животных, которые экспрессируют флуоресцентный белок-таймер Fast-FT mCherry и мембранный GFP под контролем регуляторных элементов гена Piwi1. FastFT меняет цвет флуоресценции с синего на красный по мере созревания из-за изменения хромофорной группы. В такой системе недавно возникшие i-клетки постепенно приобретают красную окраску. При этом зеленая флуоресценция идет на убыль по мере разрушения GFP. Это «перекрашивание» клеток позволило отследить процесс в реальном времени.

Оказалось, что de novo GFP⁺ i-клетки возникают примерно к шестому дню после ампутации — по-видимому, некий механизм запускает дедифференцировку клеток. С помощью EdU (5-Ethynyl-2'-deoxyuridine, флуоресцентный аналог тимидина, который встраивается в синтезирующуюся ДНК) ученые показали, что активный синтез ДНК у H. symbiolongicarpus происходит на 3–4 день после ампутации. При этом вторичные стволовые клетки возникают на шестой день. Обработка гидроксимочевиной — цитостатиком и ингибитором синтеза ДНК, который удерживает клетки в S-фазе — не смогла полностью подавить активацию Piwi1, но заметно ее снизила. После такой обработки гидрактинии не могли регенерировать и погибали. Авторы заключили, что регенерация зависит от пролиферации, происходящей до появления вторичных i-клеток.

Далее авторы использовали модельных гидрактиний, несущих репортерную метку под промотором гена β-тубулина. Эта метка экспрессировалась в дифференцированных клетках, но не в стволовых. Оказалось, что новые стволовые клетки действительно берут начало от дедифференцированных соматических. Характеризация сигнального пути Wnt/β-катенин в таких животных подтвердила эти данные. Она указала на потерю осевой полярности организма в целом и распределения нейронов гидрактинии на 2–3 день после травмы. К шестому дню полипы вновь обретали «верх» и «низ» и возвращали себе типичный план строения.

Авторы задались целью определить природу сигнала, индуцирующего появление вторичных i-клеток в ампутированных гипостомах. Они выдвинули и затем подтвердили важное предположение о роли сенесцентных клеток, на время возникающих рядом с раной, в регенерации гидрактинии. Уже известно, что клеточная сенесценция (особенно кратковременная) участвует в пластичности клеток и регенерации, в том числе у млекопитающих. Это навело исследователей на мысль, что появившиеся у гидрактинии сенесцентные клетки запускают репрограммирование своих соматических соседок.

Чтобы это изучить, исследователи провели транскриптомный анализ регенерирующих фрагментов на 0, 1, 3 и 6 сутки после ампутации. В транскриптомах они выявили 229 генов гидрактинии, которые были гомологами 279 генов-маркеров сенесценции, известных по базе данных CellAge. В частности, они обнаружили три гена, близких CDKN1A (этот ген кодирует один из ключевых регуляторов клеточного цикла — p21), которые, по-видимому, являются его паралогами. При этом у полипа нет ни одного гена, схожего со специфичным для позвоночных CDKN2A (кодирующего другой важный регулятор — p16).

In situ флуоресцентная гибридизация мРНК показала, что все три гена экспрессируются в отдельных клетках основной части тела полипа. Однако лишь один из них — Cdki1 — активен рядом с раной на первые сутки и не работает до и после этого.

Затем встал вопрос, куда исчезают «сделавшие свое дело» сенесцентные клетки. Действительно, ко 2–3 дню после ампутации соответствующие маркеры уже не заметны. При помощи трансгенных гидрактиний, экспрессировавших GFP под контролем промотора к гену Cdki1, ученые выяснили, что сенесцентные клетки перемещаются в гастродерму (стенку кишечной полости) полипа, после чего, по-видимому, просто оказываются выброшены через рот. Это происходило на вторые сутки после ампутации.

Наконец, опыты с сенолитиком (навитоклакс) и геропротекторами (рапамицин и другие ингибиторы mTOR) показали, что сенесценция необходима для нормальной регенерации гидрактинии. Это подтверждают и данные, полученные на полипах с нокаутированным при помощи CRISPR-Cas9 геном Cdki1. Во всех случаях восстановление целого организма из гипостома оказывалось невозможным.

Любопытно отметить, что описанный у Hydractinia symbiolongicarpus механизм «регенерации через старение» отличается от того, что использует очень похожая пресноводная гидра (Hydra sp.). Это стрекающее при ранении запускает апоптоз i-клеток, за которым следует начало собственно регенерации.

Как гидра регенерирует голову