Соединенные аксонами органоиды мозга обладают кратковременной пластичностью

Сети нейронов в мозге соединяются между собой аксонами, которые передают потенциалы действия и генерируют нейрональные осцилляции. За счет этого мозг и может выполнять функции высшего порядка, а нарушение связей между его участками приводит к различным нейропсихиатрическим заболеваниям, в том числе к РАС, шизофрении и эпилепсии. При моделировании нейронных сетей органоиды мозга обычно напрямую объединяют друг с другом. Хотя такие органоиды могут взаимодействовать друг с другом и иннервируют друг друга, в таких системах отсутствует белое вещество — пучки аксонов. Ученые из Японии и Франции заполнили этот пробел, вырастив органоиды мозга, соединенные аксонами, и исследовав активность нейронных сетей в них.

Исследователи выращивали пару органоидов мозга, полученных из индуцированных плюрипотентных клеток человека (иПСК). Их культивировали в течение 2–10 недель до дифференцировки клеток в кортикальные нейроны. На четвертой неделе культивирования органоиды помещали на чип, состоящий из мультиэлектродной матрицы и микрофлюидного слоя из полидиметилсилоксана. Этот чип содержал два отверстия, в каждое из которых помещали органоиды, а отверстия были соединены между собой каналом, который указывал «путь» аксонам одного органоида к другому.

За время культивации в органоидах мозга повысилась экспрессия маркеров нейрональных стволовых клеток и нейронов (PAX6, SOX2, DCX), а также маркеров кортекса (TBR1). На шестой неделе культивирования, когда органоиды выращивались на чипе уже две недели, между ними сформировался пучок аксонов, соединяющий органоиды между собой. На восьмой неделе толщина пучка выросла до 120 мкм. Большая часть клеток в органоидах была представлена VGLUT1-положительными возбуждающими нейронами (60–80% клеток), но также присутствовали и GAD67-положительные тормозящие нейроны (5–10% клеток). Электрофизиологические исследования показали, что в органоидах много зрелых нейронов, которые генерируют потенциалы действия, но также присутствуют и незрелые нейроны, чья активность слабее.

Активность нейронов ученые отслеживали с помощью мультиэлектродной матрицы чипа. Электрическая активность органоидов появилась на 4,5–5 неделях культивирования (когда органоиды уже 0,5–1 недели выращивались на чипе). Хотя они и могли генерировать спайки, не было никакой корреляции между активностью двух органоидов, потому что между ними еще не сформировались аксональные соединения. Синхронизированную активность ученые зафиксировали на 5,5–6 неделях культивирования (1,5–2 недели выращивания на чипе), когда уже начал формироваться пучок аксонов. Синхронизированные всплески активности в органоидах длились больше 100 мс и находились в низкочастотной области. Далее, на 5–7 неделях культивирования, активность нейронов в органоиде участилась и стала стала еще более синхронной. Исследователи отметили, что между всплеском активности в одном из органоидов и «ответом» во втором была небольшая задержка — меньше 100 мс. Некоторые всплески активности были одновременными, поэтому ученые предположили, что иногда органоиды могли гармонично синхронизироваться. При этом оба органоида могли инициировать всплеск активности, т. е. пучок аксонов между ними позволял передавать сигналы в обе стороны.

Ученые также охарактеризовали изменения в потенциалах локального поля (LFP) в соединенных органоидах. Спустя 6 недель культивирования (2 недели выращивания на чипе) исследователи зафиксировали медленные LFP-сигналы, которых не было до формирования пучка аксонов. Через неделю эти сигналы стали более комплексными, и ученые зафиксировали дельта-волны, что указало на появление скоординированной активности меду органоидами. На 8–9 неделях культивирования ученые также начали фиксировать тета-активность. Начиная с 5-й недели культивирования в органоидах появлялись так называемые «нейрональные лавины» (neuronal avalanches) — каскады всплесков активности, которые следуют друг за другом с промежутком 3 мс. Такие «лавины» считаются важным признаком хаотичной нейрональной активности и свидетельствуют о зрелости нейронной сети. В органоидах амплитуда таких «лавин» со временем увеличивалась, что также подтверждало формирование и созревание нейронных сетей.

Исследователи сравнили нейрональную активность органоидов, соединенных аксонами, с отдельными органоидами, а также с органоидами, объединенными напрямую. Через 6 недель культивирования всплески активности регистрировались во всех органоидах, но они чаще встречались в тех, которые были соединены аксонами. В них также была выше скорость передачи сигнала, чем внутри одного органоида. В то же время в органоидах, объединенных напрямую, скорость передачи сигнала была даже ниже, чем внутри одного органоида. Так ученые показали, что наличие пучков аксонов обеспечивает более быструю и надежную передачу сигналов между органоидами.

Дополнительный анализ показал, что в органоидах, соединенных аксонами, больше нейронов были зрелыми по сравнению с отдельными или срощенными напрямую органоидами. Пучок формировали аксоны от трети всех нейронов, входящих в органоиды, причем в таких нейронах повышалась экспрессия TBR1 и VGLUT1 — маркеров зрелых нейронов. Исследователи предположили, что наличие синаптических связей может способствовать созреванию нейронов в органоидах.

Чтобы оценить вклад аксонов в активность органоидов, ученые оптогенетически ингибировали пучок аксонов. Для этого они экспрессировали ArchT — протонную помпу, чувствительную к оранжевому свету. Когда пучок аксонов освещали оранжевым светом, высокоамплитудные всплески активности и дельта-волны исчезали, однако они вновь появлялись, когда свет убирали. Под действием света также снижалась синхронность сигналов в органоидах. Этот эксперимент подтвердил, что наличие пучка аксонов действительно способствует передаче сигналов между органоидами.

Также с помощью оптогенетики ученые показали, что соединенные аксонами органоиды обладают пластичностью. В органоидах экспрессировали каналородопсин ChR2, а пучок аксонов освещали вспышками света с длиной волны 470 нм и с промежутками 200 мс. Сначала это делали на малой частоте (0,5 Гц), что не влияло на активность органоидов, но затем частоту повышали, воздействуя на пучок аксонов на частоте 1 и 1,5 Гц по 5 мин. При увеличении частоты стимуляции повышалась нейрональная активность органоидов, причем она оставалась повышенной еще некоторое время после окончания стимуляции, но потом возвращалась к нормальным значениям. Это явление ученые и назвали кратковременной пластичностью нейронной сети. Что интересно, всплески активности в органоидах появлялись с небольшой задержкой — 80 с после стимуляции, что указывало на постепенную адаптацию нейронов к стимуляции. Во время повторных сессий стимуляции органоидов задержка сокращалась. Механизм пластичности был связан с кальций-зависимыми сигнальными путями, так как при действии на органоиды K252a — ингибитором ключевых для них киназ CaM — снижалось время активации нейронных сетей после стимуляции.

В то же время ученые отметили, что при использовании другой линии иПСК для выращивания органоидов они получали немного другие результаты в таком эксперименте. При стимуляции таких органоидов тоже проявлялась задержка, которая сокращалась при повторной стимуляции. Однако ученые не наблюдали поддержания активности нейронных сетей после окончания стимуляции. Они заключили, что на пластичность органоидов оказывает влияние вариация между исходными клеточными линиями.

Таким образом, ученые вырастили органоиды, соединенные пучком аксонов. Такие органоиды проявляли сложные паттерны активности, а наличие аксональных связей ускоряло передачу сигналов между ними. Исследователи также продемонстрировали, что для этих органоидов характерна пластичность — кратковременная потенциация после оптической стимуляции. Соединенные между собой органоиды могут стать удобной моделью для изучения болезней, для которых характерна аномальная активность мозга, а также заболеваний со структурными дефектами аксонов или мозолистого тела. Однако пока что у таких органоидов есть и недостатки: недостаточная зрелость нейронов и отсутствие долговременной потенциации — важной части синаптической пластичности.

Слияние митохондрий обеспечивает синаптическую пластичность нейронов гиппокампа