Создан репликон SARS-CoV-2 без S-белка для безопасных исследований

Вирусные репликоны — это небольшие молекулы РНК, способные реплицироваться; они экспрессируют вирусные белки, которые необходимы для репликации, но не производят инфекционные вирионы. Репликоны могут персистировать в клетках и передаются в дочерние клетки во время деления. Такие конструкции удобно использовать для тестирования кандидатных препаратов, влияющих на репликацию, транскрипцию и трансляцию вируса, а также на функции отдельных вирусных белков. Кроме того, репликоны — это удобная платформа для создания вакцин. Так, подобную вакцину против SARS-CoV-2 на основе репликона лошадиного альфа-вируса разрабатывает компания VaxEquity совместно с AstraZeneca. Наконец, репликоны — это неоценимое подспорье для исследований опасных вирусов. В отличие от псевдовирусов SARS-CoV-2 на основе лентивирусов или рабдовирусов, с помощью которых можно исследовать только свойства и контакты S-белков, репликоны позволяют исследовать остальные элементы вируса.

На основе генома вируса SARS-CoV-2 авторы создали модульную конструкцию, в состав которой вошли гены всех белков вируса, кроме гена S-белка. Вместо него под тем же регуляторным элементом вставили ген резистентности к неомицину (NeoR) и репортерный ген (NeonGreen или люцифераза).

Для оценки работы полученных репликонов ими «инфицировали» клетки Huh-7.5 (гепатоциты человека) с помощью электропорации. Через сутки наблюдали за активностью репортера, люциферазы Gaussia, измеряя люминесценцию. Люминесценции не было, если из репликона исключали ген полимеразы, и она существенно снижалась при обработке клеток ремдесивиром, ингибитором полимеразы, или маситинибом, ингибитором вирусной протеазы 3СLpro.

Также клетки обрабатывали АМ580 — веществом, обладающим широкой противовирусной активностью, нацеленным не на вирус, а на клеточный метаболизм. Его действие также приводило к ингибированию репликона. Кроме того, активность репортера существенно снижалась, когда производили нокаут трансмембранного белка клетки-хозяина TMEM41B, важного для жизненного цикла различных коронавирусов.

Репликоны с мутациями в белке Nsp1, супрессоре клеточной трансляции, оказались гиперчувствительными к действию интерферонов альфа и бета по сравнению с репликонами дикого типа. Это говорит о том, что Nsp1 блокирует работу интерферон-зависимых генов и снижает первичный клеточный ответ на инфекцию. Также мутации в этом гене приводили к лучшей выживаемости клеток и устойчивости к токсическому действию ремдесивира, поэтому в дальнейших опытах в репликон включали и эти мутации.

Для более «аутентичной» доставки репликона в клетки ученые решили разработать отдельную конструкцию, в которой бы был собран вирион с S-белком, способный взаимодействовать с клеткой и инфицировать ее, но только один раз. Для этого клетки BНК-21 трансфицировали плазмидой, кодирующей S-белок без окружающих его нетранслируемых вирусных последовательностей (чтобы избежать рекомбинации), а затем через электропорацию вводили в эти клетки SΔ-репликон. В результате получали вирусоподобные частицы (RDP, replicon delivery particles), которыми затем инфицировали гепатоциты и наблюдали за инфекцией по репортеру NeonGreen. При пассировании этих клеток репликон с репортером не детектировался, т.е. новые RDP не образовывались.

RDP проверили на возможность применения в реакции нейтрализации, которую часто проводят на псевдовирусах. Для этого взяли два хорошо охарактеризованных человеческих моноклональных антитела, а в оболочках RDP использовали S-белок двух видов — из изолята WA1/2020 и из штамма B.1.351 (бета). В этих экспериментах результаты были сопоставимы с теми, что были получены на живом вирусе SARS-CoV-2.

Другим вариантом доставки репликона в клетку стало псевдотипирование с помощью G-белка вируса везикулярного стоматита, который взаимодействует с LDL-рецептором (рецептором липопротеинов низкой плотности). «Одевание» репликона в эту оболочку проводили примерно по такой же схеме, что и создание RDP, только использовали плазмиду, кодирующую G-гликопротеин. Такие частицы успешно однократно инфицировали разные типы клеток человека и обезьян.