Создан вариант Cas9 с пониженной требовательностью к контексту последовательности-мишени и эффективно повышающий его транскрипцию

Американские исследователи провели высокопроизводительный скрининг вариантов белка Cas9, которые легче распознают последовательность-мишень из-за пониженных требований к последовательности PAM. Для связывания Cas9 с мишенью необходимо, чтобы рядом с ней располагалась консенсусная последовательность NGG (N — любой нуклеотид). Если стоит задача нокаутировать ген, то требование к консервативной последовательности PAM не создаёт серьёзной проблемы: мотив NGG можно обнаружить в последовательности почти любого гена. Если же Cas9 используется для других целей, например, активации или подавлении транскрипции гена-мишени, то сайт связывания этого белка уже должен быть приурочен к строго определённому участку гена, и далеко не факт, что на подходящем расстоянии найдётся последовательность вида NGG. Для преодоления этой проблемы были созданы два варианта Cas9 — xCas9 и Cas9-NG, у которых PAM сокращён до консенсуса NG. Однако не было известно, как отличается активность этих форм Cas9 от белка дикого типа.

Чтобы оценить эффективность работы Cas9, xCas9 и Cas9-NG, исследователи провели широкомасштабный параллельный скрининг, в ходе которого анализировали результаты работы белков на тысячах сайтов-мишеней в человеческом геноме. Cas9 и его варианты использовались для трёх ключевых задач: нокаута гена-мишени, активации его транскрипции или её подавлении (в последних двух случаях, когда не требовалось внесение разрезов в последовательность-мишень, использовались варианты Cas9, не имеющие нуклеазной активности). Оказалось, что во всех трёх случаях гибкость ферментов в отношении PAM в отрицательную сторону сказывалась на их активности. На PAM, имеющих вид NGG, Cas9 превосходил вариантные формы и в случае нокаута гена-мишени, и в случае активации или репрессии его транскрипции. В то же время на PAM вида NGH (где H — A, С или T) вариант Cas-NG оказался эффективнее, чем xCas9, в случае всех трёх задач. Чтобы повысить нуклеазную активность xCas9, исследователи получили новый вариант Cas9, который имел мутации, характерные и для xCas9, и для Cas-NG. Новый вариант Cas9 получил название xCas9-NG. xCas9-NG. По выраженности нуклеазной активности он превосходит xCas9 (хотя и уступает по этому параметру Cas9 дикого типа), более того, как инструмент для активации генов эта форма Cas9 оказалась эффективнее, чем xCas9 и Cas9-NG, как в случае PAM вида NGG, так и в случае PAM вида NGH. Авторы работы полагают, что полученный ими вариант Cas9 с пониженной требовательностью к PAM станет удобным подспорьем в тех случаях, когда Cas9 дикого типа не может эффективно распознавать последовательность-мишень.