Стеатоз печени при миотонической дистрофии 1 типа исследовали на трансгенных мышах
Миотоническая дистрофия 1 типа вызывается экспансией тандемных повторов CTG в гене DMPK, что приводит к образованию шпилек в РНК и нарушению сплайсинга. У больных миотонической дистрофией повышен риск развития стеатоза печени, и они аномально чувствительны к анестетикам и миорелаксантам. Ученые из США получили мышей, у которых характерные для миотонической дистрофии тандемные повторы экспрессируются только в печени, и описали патогенез в этом органе при миотонической дистрофии.
Миотоническая дистрофия 1 типа — это аутосомно-доминантное заболевание, которое характеризуется миотонией, прогрессирующей дистрофией мышц, нарушением работы сердца и повышенной утомляемостью. Это вторая по частоте форма мышечной дистрофии. Миотоническая дистрофия вызывается мутацией в гене DMPK, которая приводит к удлинению тандемных повторов CTG в 3'-нетранслируемой области гена. В транскрибируемой с мутантного гена РНК появляются повторы CUG, из-за которых РНК образует шпильки. В результате в ядре накапливаются агрегаты РНК, с которыми связываются белки семейства MBNL, участвующие в альтернативном сплайсинге и полиаденилировании транскриптов при развитии разных тканей.
Большинство исследований миотонической дистрофии посвящено ее проявлениям в мышцах, сердце, мозге. Однако есть данные, которые говорят о вовлеченности в патогенез еще и печени. Так, среди больных миотонической дистрофией чаще встречается стеатоз печени, метаболический синдром и другие болезни печени. Кроме того, такие пациенты аномально чувствительны к ряду анестетиков и миорелаксантов: они не только дольше отходят от их действия, но и вообще могут не проснуться от анестезии. Взяв эти факты на вооружение, исследователи из Иллинойсского университета в Урбане-Шампейне (США) получили мышиную модель, на которой изучили патологию печени при миотонической дистрофии.
Авторы скрестили две линии трансгенных мышей: тетрациклин-индуцибельную модель с человеческим DMPK, который содержит 960 повторов CTG, и модель, несущую тетрациклиновый транс-активатор под промотором ApoE, который специфичен для гепатоцитов. В результате получилась мышиная модель DM1 с условной доксициклин-зависимой экспрессией тандемных повторов в DMPK только в печени. Чтобы запустить развитие болезни у новорожденных мышей, сначала беременной самке, а затем ее мышатам добавляли в корм доксициклин.
Исследователи подтвердили, что у полученной мышиной модели наблюдаются молекулярные изменения, характерные для миотонической дистрофии. С помощью FISH они обнаружили, что в ядрах большинства гепатоцитов находится конденсированная РНК с повторами CUG, причем с этими участками связываются белки MBNL. В большинстве ядер присутствовал хотя бы один такой участок.
Экспрессия РНК с 960 повторами CUG в гепатоцитах изменяла их транскриптом. В гепатоцитах мышей DM1 паттерн альтернативного сплайсинга и полиаденилирования значительно отличался от того, что был у мышей контрольной группы. Менялся также уровень экспрессии ряда генов. Изменения затронули транскрипты, связанные с метаболизмом глюкозы и липидов, а также активностью оксидоредуктаз и цитохрома р450, процессингом мРНК и иммунным ответом.
Далее исследователи оценили патологию печени при миотонической дистрофии. При этой болезни часто наблюдается преддиабет, поэтому ученые измерили уровень глюкозы в крови мышей. Разница в уровнях глюкозы наблюдалась только между самцами DM1 и контролем, а у самок такой разницы не было; в глюкозотолерантном тесте тоже не было различий. При этом оказалось, что повышенный уровень глюкозы наблюдается у мышей HSA L/R — модели, в которой повторы CTG представлены только в мышечных клетках. Таким образом ученые показали, что преддиабет не связан с патологией печени.
Гистологический анализ печени у мышей DM1 выявил наличие лобулярного воспаления, некротических участков и фиброза. У мышей HSA L/R таких изменений в печени не было. Исследователи также обнаружили, что у мышей DM1 в печени накапливаются липиды — их уровень был почти в 2 раза выше по сравнению с контролем и нормализовался после прекращения приема доксициклина. В печени мышей HSA L/R липиды не накапливались — их накопление, таким образом, было связано именно с патологией печени.
Печень — главный орган, который участвует в метаболизме лекарств, поэтому ученые предположили, что при миотонической дистрофии нарушается метаболизм ксенобиотиков. Они проверили, действительно ли мыши DM1 аномально реагируют на различные анестетики и миорелаксанты. Мышам вводили зоксазоламин — миорелаксант, который в норме временно вызывает мышечный паралич. Мышам DM1 требовалось как минимум на 50% больше времени, чем контрольным животным, на то, чтобы отойти от действия препарата и снова начать свободно двигаться.
Исследователи также оценили действие на таких мышей парацетамола. Его высокие дозы приводят к поражению печени, что связано с выработкой токсичного N-ацетил-п-бензохинона, который образуется при окислении парацетамола цитохромом P450 в гепатоцитах. Если активность этого фермента слишком высока, токсический эффект может наблюдаться даже при низких дозировках парацетамола; напротив, если цитохром не работает, то никаких токсических эффектов нет. В эксперименте мышам вводили 350 мг/кг парацетамола — полулетальную дозу. В контрольной группе за 8 ч после введения погибло больше животных, чем в группе DM1. Через 24 ч собрали печень животных, и оказалось, что в контрольной группе чаще встречался некроз печени. В печени мышей DM1, напротив, некротических участков было меньше, хотя и наблюдались повреждения печени. Ученые также показали, что в гепатоцитах мышей DM1 снижена экспрессия цитохрома P450 и сульфотрансферазы 2a1 — еще одного фермента, который участвует в метаболизме парацетамола. Так исследователи подтвердили, что при миотонической дистрофии действительно снижается способность печени к метаболизму ксенобиотиков.
Далее ученые проверили, предрасположены ли мыши с миотонической дистрофией к стеатозу печени. Для этого мышей DM1 перевели на диету, богатую жирами, углеводами и холестерином. На такой диете мышей содержали 8 недель, а потом проводили глюкозотолерантный тест и измеряли уровень глюкозы натощак. Как и до этого, различий между контрольной группой и мышами DM1 не было. Вместе с тем в их печени накапливалось гораздо больше липидов, наблюдались стеатоз и воспаление, а также участки некроза. Также у мышей DM1, которых содержали на такой «западной» диете, значительно повышалось отношение массы печени к массе тела.
Чтобы понять, что именно приводит к стеатозу печени, исследователи подробнее рассмотрели изменения в паттерне сплайсинга транскриптов, связанных с липидным транспортом и метаболизмом. Особенно сильно были изменены экспрессия и сплайсинг ацетил-КоА-карбоксилазы 1 (АСС1) — фермента, который перерабатывает избыток цитрата в свободные жирные кислоты. Активность ACC1 регулируется фосфорилированием фермента разными киназами и дефосфорилированием фосфатазой PP2A; также для активации ACC1 фермент должен димеризоваться. В транскрипте Acc1 находится экзон 28, который в норме вырезается в некоторых тканях: в мозге, в молочных железах, яичниках и в печени. Это приводит к тому, что фермент больше фосфорилируется, и его активность снижается. В гепатоцитах мышей DM1 экзон 28 встречался в транскриптах Acc1 примерно на треть чаще, чем у контрольной группы. При этом, что интересно, на сплайсинг этого транскрипта не влиял белок MBNL1. С помощью количественной ОТ-ПЦР ученые показали, что у DM1 мышей в печени экспрессия Acc1 повышена в два раза, чем у контрольных мышей, а Вестерн-блот и капиллярный иммунологический анализ подтвердили, что и уровень белка повышается вдвое.
Чтобы понять, вызывалось ли повышение экспрессии изоформы ACC1 с экзоном 28 миотонической дистрофии или стеатозом, ученые получили модель DM1 с острой миотонической дистрофией. В хроническом варианте, который анализировали до этого, экспрессию удлиненных тандемных повторов в гепатоцитах запускали сразу у новорожденных мышей. Теперь же мышей сначала выращивали до возраста 8 недель, а потом переводили на диету с добавками доксициклина. У мышей с острой миотонической дистрофией не было стеатоза. На транскриптомном уровне экспрессия многих генов, связанных с биосинтезом, транспортом и метаболизмом липидов в острой и хронической моделях совпадала. Что важно, в обоих моделях наблюдался миссплайсинг Acc1, уровень белка ACC1 был повышен на 54% по сравнению с контрольными мышами. Следовательно, изменения в регуляции ACC1 — прямое последствие миотонической дистрофии.
Чтобы выяснить, вызывает ли повышенная экспрессия изоформы ACC1 стеатоз на фоне миотонической дистрофии, мышам DM1 с хронической формой болезни вводили антисенс-олигонуклеотиды, направленные на экзон 28 Acc1. В результате в трансрипты Acc1 в гепатоцитах таких мышей этот экзон включался на 60% реже. Несмотря на это, значительных улучшений при стеатозе не наблюдалось.
Затем ученые применили ингибитор ACC1 (CP-640186), чтобы понять, связано ли развитие стеатоза с самим этим ферментом. Всего через 5 дней приема этого ингибитора у мышей DM1 значительно уменьшился стеатоз, хотя при этом не изменялась экспрессия большинства генов, связанных с метаболизмом липидов. Вместе с тем, несмотря на лечение, у мышей все еще сохранялось воспаление печени и повышенный индекс массы печени к массе тела. Исследователи предположили, что эти проявления патологии печени либо не связаны с ACC1, либо требуют более длительного приема ингибитора ACC1. Вместе с тем ACC1 может стать терапевтической мишенью для лечения стеатоза у пациентов с миотонической дистрофией.
Молекулярная терапия миотонической мышечной дистрофии не дает эффекта без физических упражнений
Источник
Dewald, Z. et al. Altered drug metabolism and increased susceptibility to fatty liver disease in a mouse model of myotonic dystrophy. // Nature Communications (2024). DOI: 10.1038/s41467-024-53378-z