Терминаторы-«клапаны» позволяют управлять соотношением транскрипционных изоформ

Контроль над экспрессией генов позволяет ученым управлять поведением клеток. Для этого они создают искусственные генетические элементы (например, промоторы, терминаторы), которые помогают настраивать транскрипцию и трансляцию необходимых генов.

У прокариот в зависимости от эффективности терминации РНК-полимераза может либо остановить синтез РНК в районе терминатора, либо продолжить его. В результате образуются молекулы РНК разной длины. Обычно ученые при создании искусственных терминаторов стараются максимально повысить их эффективность, чтобы все продукты транскрипции были одной длины. Таким образом стараются отделить разные гены друг от друга. В новой работе исследователи из Великобритании предложили использовать терминаторы как «клапаны», которые позволяют регулировать уровни транскрипции соседних последовательностей.

Авторы разрабатывали терминаторы-«клапаны» на примере РНК-полимеразы бактериофага Т7, которую часто используют в синтетической биологии. Для этой полимеразы охарактеризован только один природный терминатор из генома самого бактериофага, а также несколько искусственно созданных вариантов.

Сначала исследователи создали библиотеку предполагаемых терминаторов. В нее вошел природный терминатор бактериофага Т7, 11 терминаторов кишечной палочки Escherichia coli с разной эффективностью и контрольная последовательность, которая не содержала специфичных для терминаторов особенностей структуры («шпильки») и богатого тиминами участка.

На эффективность терминации влияет и участок непосредственно перед терминатором, так что в библиотеку добавили 13 вариантов этих участков разной длины и состава. Кроме того, исследователи варьировали составом спейсеров, чтобы проследить, как другие элементы повлияют на терминаторы. Всего в библиотеке оказались 1183 варианта терминаторов.

Для описания всех полученных транскриптов использовали прямое нанопоровое РНК-секвенирование. Каждый из терминаторов сам по себе являлся кодом, который позволял соотнести сиквенс транскрипта с тестируемым элементом.

Ученые выяснили, как, например, длина богатого тиминами участка терминатора влияет на эффективность терминации. Эти данные позволили проанализировать, какие вторичные структуры РНК образуются в каждый момент терминации, а также их влияние на этот процесс.

Кроме того, данные о том, как генетический контекст влияет на разные терминаторы, позволил выбрать те из них, которые оказались больше всего чувствительны к окружающим генетическим элементам. Такие терминаторы можно настраивать, внося изменения в участки перед ними. Например, эффективность слабых терминаторов повышалась с увеличением количества урацилов в U-участке.

Также исследователи показали, как подобные «клапаны» можно применить на практике. Авторы попытались настроить соотношение, в котором нарабатываются различные гидовые РНК для системы CRISPR-Cas9. Для этого протестировали четыре сочетания, в каждом из которых два разных клапана отделяли друг от друга три гидовые РНК. Ученые получили различные соотношения трех гРНК, но в целом эффективность терминации была ниже предсказанной. Несмотря на это, авторы работы утверждают, что их результаты позволят дальше изучать терминаторы как регуляторные элементы для управления РНК-транскриптами.