Ученые из Москвы разработали экспресс-анализ на биомаркеры острого инфаркта миокарда

Анализ крови на специфические маркеры воспаления позволяет в короткие сроки диагностировать то или иное заболевание. Четыре белка плазмы человека — C-реактивный белок, цистатин C, миоглобин и D-димер — кардиомаркеры, которые при одновременном определении отражают воспалительный или тромбоэмболический статус пациента и играют значимую роль в ранней диагностике острого инфаркта миокарда. Ученые из Института биохимической физики имени Н.М. Эмануэля РАН, Института биохимии имени А.Н. Баха РАН и Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова разработали экспресс-анализ этих белков, основанный на иммуномагнитной экстракции целевого аналита и одновременном мечении его флуоресцентным красителем.

Субстратом для экстракции и концентрирования аналита были магнитные шарики, часто используемые в аналитической химии для разделения смесей и для обнаружения конкретных соединений. В сочетании с флуоресцентным анализом данный метод позволил сократить время процедуры и увеличить количество одновременно определяемых маркеров.

Поверхность магнитных шариков функционализировали моноклональными антителами, специфичными к каждому из четырех белков, так обеспечивалась селективность. Также синтезировали конъюгаты антител к тем же белкам с флуорофором BDP 558/568. Методику отрабатывали отдельно на каждом аналите, а затем объединили за счет автоматизированной биоаналитической платформы, состоящей из чипа с реагентами, манипулятора, промывочных микронасосов и системы детектора флуоресценции с длиной волны лазера 532 нм.

Аликвоту образца плазмы смешивали с магнитными шариками, меченными моноклональными антителами, и с флуоресцетными конъюгатами, распределенными по 4 лункам. Поскольку нормальные концентрации определяемых белков в плазме крови различаются на два порядка (миоглобин — 6–85 нг/мл, D-димер — 0–250 нг/мл, цистатин С — 800–1200 нг/мл, С-реактивный белок — около 1000 нг/мл, при остром воспалении его концентрация может возрастать до 500 мкг/мл), для обнаружения миоглобина и D-димера образцы разбавляли флуоресцентными конъюгатами двукратно, а для обнаружения С-реактивного белка и цистатина-С применялось десятикратное разбавление. Далее проводили инкубацию и промывку с помощью постоянного магнита, в результате чего получали иммобилизованные магнитные шарики с образцом, меченым флуорофором (см. рисунок). Референсным методом для верификации методики был ИФА.

Стоит отметить, что длительность инкубации (для достижения максимальной интенсивности флуоресценции) для разных белков различна, поэтому исследователи выбрали для каждого белка наименьшее время, обеспечивающее наилучшую чувствительность. Это позволило проводить одновременно инкубацию нескольких аналитов в автоматизированном режиме. Общее же время анализа, включая введение образца, смешивание, инкубацию, промывку и детекцию, — 14 минут.

Для проверки методики авторы провели иммуноанализ данных биомаркеров в плазме крови семи здоровых доноров. Результаты сравнивали с независимыми измерениями, предоставленными коммерческой лабораторией ИНВИТРО для тех же доноров. Концентрации белков плазмы, определенные с помощью новой методики, хорошо согласовывались с данными ИНВИТРО с учетом стандартной ошибки.

Автоматизация процесса упростила анализ и значительно сократила затраты времени. Предложенная платформа количественно определяет четыре биомаркера за 14 минут, при этом достаточно всего 17 мкл плазмы. На ее основе может быть создан стационарный аналитический прибор, отмечают исследователи.

На вопросы PCR.news отвечает первый автор статьи Наталья Нечаева (ИБФХ им. Н.М. Эмануэля РАН):

— Есть ли сейчас на рынке диагностики ССЗ аналитические устройства для выявления маркеров воспаления? Как сейчас делаются анализы на эти биомаркеры и сколько это занимает времени?

— Конечно, на рынке анализа маркеров, не только СС, но и вообще каких-то потенциально важных веществ, очень много разного оборудования. Анализируют разные маркеры, в том числе и сердечно-сосудистые, в частности тропонин, как один из самых важных показателей острого инфаркта миокарда. Про точность и время анализа, к сожалению, сказать не могу. Где-то заявляется, что есть коммерческие экспресс-тесты, выявляющие биомаркеры за 2 минуты, во всяком случае, есть масса подобных рекламных буклетов.

— Применяются ли подобные приборы в России?

— Нет, насколько мне известно; мы не так много работали с клиникой. У нас применяют просто ИФА-анализаторы, и измеряют они по одному маркеру, одновременных измерений четырех-шести не производится. В клинике обычно берут много пациентов за раз, и стандартную 96-луночную плашку ИФА используют для определения одного аналита.

— Что необходимо для практической реализации предлагаемой методики? Какие трудности могут возникнуть?

— По сути, у нас уже готовый прибор, но он один. Естественно, нет никакого серийного производства, и для того, чтобы его наладить, нужен какой-то промышленный партнер, инвестиционная поддержка, потому что в НИИ нет возможности поставить производство на конвейер. Конечно, хочется больше кастомизировать определяемые аналиты, в соответствии с запросом: если востребован одновременный анализ не упомянутых в статье, а каких-то других аналитов, то реализовать анализ именно для них. Чтобы уже врачи нам подсказали, что актуальнее.

— Система была проверена на здоровых донорах. Планируется ли проверка на пациентах с подозрением на инфаркт миокарда?

— Да, у нас была такая работа, просто не все опубликовано. Работали с клиникой, с пациентами — 50–60 человек, у которых эти белки были повышены. Анализ работает и для патологических значений, для одних белков лучше, для других — чуть хуже.