В протеоме бактерии нашли термостабильные противомикробные ферменты

Пептидогликан, входящий в состав клеточной стенки бактерий, считается перспективной мишенью для антимикробных средств, так как риск развития устойчивости в таком случае снижен. На пептидогликан воздействуют, например, лизины бактериофагов, способные гидролизовать его. Китайские ученые нашли в протеоме бактерии Acinetobacter baumannii пять новых лизинов, два из которых оказались устойчивыми к высоким температурам.

Чтобы обнаружить новые лизины, исследователи проанализировали протеом бактерии A. baumannii, используя в качестве шаблона ранее известный антимикробный пептид P307, который является компонентом лизина PlyF307 и действует против той же бактерии. В результате ученые нашли 204 потенциальные пептидогликангидролазы, после анализа которых выделили всего пять лизинов и продолжили работу с ними: PHAb11, PHAb10, PHAb9, PHAb8 и PHAb7.

Для дальнейших экспериментов ученые наработали найденные лизины в клетках кишечной палочки. Все вещества были активны против A. baumannii в довольно низкой концентрации (2,5 мкг/мл), а также против бактерии Pseudomonas aeruginosa и Escherichia coli. Наибольшую активность проявляли PHAb10 и PHAb11. Их дополнительно проверили на образцах культур A. baumannii, P. aeruginosa, E. coli, Klebsiella pneumoniae, Streptococcus suis, Enterococcus faecalis, Staphylococcus aureus. PHAb10 и PHAb11 убивали эти бактерии, когда они находились и в стационарной, и в экспоненциальной фазе роста, однако на золотистый стафилококк лизин PHAb11 мог воздействовать только в экспоненциальной фазе.

PHAb10 и PHAb11 также оказались активны против клинических изолятов A. baumannii, P. aeruginosa, E. coli, K. pneumonia, S. aureus, E. faecalis, S. dysgalactiae, S. agalactiae, S. pyogenes, S. pneumoniae, S. suis. При этом даже те бактерии, которые уже были устойчивы к антибиотикам, сохраняли чувствительность к лизинам. Исследователи также отметили, что PHAb11 был более активен против грамположительных бактерий, тогда как PHAb10 — против грамотрицательных.

Дополнительно проверив свойства этих лизинов, ученые выяснили, что PHAb11 и PHAb10 сохраняют активность в диапазоне pH 5,0–10,0, причем оптимальным является уровень pH 7,0. Удивительным оказалась термостабильность обоих лизинов: они не теряли своей активности даже после кипячения в течение одного часа. Три других лизина, PHAb7, PHAb8 и PHAb9, напротив, теряли активность после нахождения при 70℃ в течение часа.

Чтобы объяснить разницу в устойчивости лизинов к высоким температурам, исследователи получили их кристаллические структуры. Оказалось, что нетермостойкий PHAb8 представляет собой мономер, тогда как PHAb10 и PHAb11 являются димерами, молекулы которых связаны между собой семью водородными связями. При повышенной температуре они теряют свою конформацию, но восстанавливают ее при повторном охлаждении.

Исследователи также объяснили разницу в активности PHAb10 и PHAb11 против грамотрицательных и грамположительных бактерий. Оба лизина содержат каталитический домен лизоцима, а также катионный пептид на одном из концов. У PHAb10 такой антимикробный пептид находится на C-конце, а у PHAb11 — на N-конце. Исследователи также получили эти антимикробные пептиды по отдельности и протестировали их против бактерий A. baumannii, P. aeruginosa, S. aureus и E. faecalis в экспоненциальной и стационарной фазах. Пептид, входящий в состав PHAb11, оказался более активным по сравнению с PHAb10. Оба пептида были необходимы для работы обоих эндолизинов, причем при удалении пептидной части лизины могли разрушать пептиогликан грамотрицательных бактерий, но не грамположительных. Следовательно, каталитический домен лизинов позволяет им убивать грамотрицательные бактерии, а благодаря антимикробным пептидам в их составе они также приобретают активность против грамположительных бактерий.

Лизин PHAb10 проверили на мышах. В одном эксперименте у мыши был ожог, и на нее сначала наносили 10 мкг PHAb10, а затем заражали бактерией A. baumannii. По сравнению с контрольными животными у мышей, которые предварительно получали лизин, в месте инфекции оставалось меньше живых бактерий. При этом лизин PHAb10 был так же эффективен, как и антибиотик миноциклин. В другом эксперименте лизин использовали для лечения абсцесса. Сначала мышь заражали бактерией A. baumannii, вводя ее суспензию подкожно, а потом лечили ее 10 мкг PHAb10, также вводимым подкожно. В этом опыте лизин не только помог избавиться от инфекции, но и оказался гораздо эффективнее антибиотика.

Новый класс антибиотиков подавляет транспорт липополисахаридов