В уязвимости нейронов к тау-белку виноват протоонкоген Dek

На ранних стадиях болезни Альцгеймера в разных популяциях клеток мозга начинают накапливаться агрегаты белков. При этом в неокортексе и в гиппокампе преобладают амилоидные бляшки, а нейрофибриллярные клубки из гиперфосфорилированного тау-белка начинают накапливаться в нейронах второго слоя энторинальной коры (ECII). Она поражается на продромальной стадии болезни Альцгеймера, когда еще нет проявлений когнитивных нарушений. Авторы публикации в журнале Brain предположили, что нейроны ECII служат резервуаром для патологических форм тау-белка, из которого белок потом распространяется в другие части мозга. Поэтому исследователи заинтересовались, что именно делает эти нейроны уязвимыми к накоплению тау-белка.

Ранее ученые использовали биоинформатический подход, чтобы создать функциональную карту генов в нейронах ECII. С помощью алгоритма NetWAS 2.0 они нашли несколько групп генов, которые могут способствовать образованию нейрофибриллярных клубков при болезни Альцгеймера. Анализ этих данных показал, что ключевым регулятором таупатии в уязвимых нейронах может быть протоонкоген DEK, который способен функционально взаимодействовать с MAPT — геном, кодирующим белок тау. DEK — это протоонкоген, кодирующий ядерный фосфопротеин DEK. Сам онкоген был открыт в пациентах с острым миелоидным лейкозом, а его экспрессия повышена в солидных опухолях и также ассоциирована с аутоиммунными заболеваниями. При этом DEK также экспрессируется в ЦНС, хотя его функции остаются неизвестными.

Для исследования функций этого протоонкогена ученые использовали как in vitro, так и in vivo системы. Они трансфицировали первичные культуры мышиных нейронов энторинальной коры аденоассоциированными вирусами, несущими кДНК Dek или короткие шпилечные РНК против этого гена, чтобы получить клетки со значительной оверэкспрессией или сайленсингом Dek. При этом секвенирование РНК показало, что сайленсинг Dek оказывает больше влияния на транскриптом, чем его оверэкспрессия. Поэтому в мышиной in vivo модели ученые только «заглушили» Dek в нейронах ECII.

Анализируя транскриптом полученных in vitro и in vivo, ученые подтвердили предсказательную способность своей in silico модели. Те гены, которые, согласно биоинформатическому анализу, должны были быть ассоциированы с DEK, как раз были больше всего затронуты при сайленсинге Dek как в in vitro культуре нейронов, так и в нейронах ECII in vivo. Многие среди них были ассоциированы с уязвимостью этих нейронов к болезни Альцгеймера. В частности, при сайленсинге Dek понизилась экспрессия генов, функции которых затрагивали микротрубочки, развитие нейронов, аутофагию, аксоногенез и долговременную потенциацию (LTP).

Про DEK известно, что он может регулировать структуру хроматина, связываясь с ним, а, следовательно, он способен влиять и на экспрессию генов. Чтобы проверить это, ученые использовали метод ATAC-seq (assay for transposase-accessible chromatin using sequencing), позволяющий оценить степень открытости хроматина. В первичной культуре нейронов энторинальной коры после сайленсинга Dek изменилась степень открытости хроматина в промоторных регионах 20 генов, что привело к изменению экспрессии 13 из них. Больше всего изменения затронули Egr1 — фактор транскрипции, который относится к генам немедленного и раннего ответа (immediate early genes, IEG). Его экспрессия была понижена в моделях и in vitro, и in vivo, хотя при этом хроматин был открыт в ближайших к этому гену энхансерном и промоторном регионах.

Экспрессия IEG служит маркером активации нейронов и считается важной для поддержания синаптической пластичности. Чтобы оценить влияние DEK на Egr1, исследователи деполяризовали нейроны в первичной культуре, а затем отслеживали изменения в экспрессии Egr1. В обоих случаях деполяризация привела к повышению экспрессии Egr1, но при сайленсинге Dek это повышение было в 2,5 раза сильнее, чем в контроле. Исходный низкий уровень экспрессии Egr1 ученые объяснили второстепенными изменениями в нейронах, которые компенсировали их чрезмерную активацию. Так, за активацией следовало понижение экспрессии AMPA-рецепторов Gria1, 2, 3 и 4.

DEK способен регулировать функции ацетилтрансфераз и деацетилаз гистонов, таким образом выступая эпигенетическим регулятором экспрессии генов. С помощью масс-спектрометрии исследователи провели скрининг всех посттрансляционных модификаций гистонов в первичной культуре нейронов с сайленсингом Dek и без него. По сравнению с контролем в нейронах с «заглушенным» Dek более чем в 10 раз чаще встречалась метка H3.1K36ac. Из-за отсутствия специфических антител к ней такая метка плохо изучена, однако литературные данные показали, что она может встречаться в активно транскрибируемых участках генома, в том числе в локусе Egr1. Поэтому ученые предположили, что функция DEK может быть связана с этой меткой.

Используя метод локальной фиксации потенциала (patch clamp analysis), ученые оценили электрические свойства первичной культуры нейронов энторинальной коры с «заглушенным» Dek. Такие нейроны были значительно гипополяризованы по сравнению с контролем, что, вероятно, было связано с нарушением экспрессии калиевых и натриевых потенциал-управляемых каналов. В клетках с сайленсингом Dek также повысилась амплитуда падения напряжения (sag). Все это характерно для нейронов, в которых накапливаются патологические формы белка тау.

В первичной культуре нейронов с Dek-сайленсингом уровень белка тау действительно был повышен, причем белок концентрировался в соматодендритических синапсах, что характерно для ранних стадий болезни Альцгеймера. Однако при этом ученые не обнаружили фосфорилирования ни в сайте Thr231, что характерно для ранних стадий болезни, ни в сайтах Ser202 и Thr205, что ассоциировано с поздними стадиями. Профиль фосфорилирования белка тау, однако, все же был нарушен, так как была снижена степень фосфорилирования сайта Thr181, также встречающегося при ранних стадиях болезни Альцгеймера. Кроме того, в нейронах был нарушен процесс аутофагии. При сайленсинге Dek в нейронах повышался уровень связанной с липидами формы белка LC3, которая необходима для формирования аутофагосомы. Однако при этом понижалась экспрессия гена Dnajc6, кодирующего ауксилин — белок, обеспечивающий лизосомную функцию аутофагосомы; мутации в этом гене ассоциированы с болезнью Паркинсона.

Чтобы оценить влияние Dek на таупатию in vivo, ученые «заглушили» этот ген в нейронах ECII мышах hMAPT, у которых ген, кодирующий мышиный тау, был заменен на человеческий. Через 2 недели после сайленсинга у мышей наблюдалась потеря нейронов, а во втором слое энторинальной коры появилась реактивная микроглия. Исследователи предположили, что для нейронов с сайленсингом Dek характерна аномальная возбудимость, на которую и реагировала микроглия, что в итоге и приводило к потере нейронов. Если ученые устраняли микроглию, то нейроны ECII выживали, однако через 2 недели после сайленсинга Dek в них накапливался тау-белок.

Таким образом, ученые показали, что протоонкоген Dek нарушает возбудимость нейронов ECII у мышей, что приводит к накоплению тау-белка и активации реактивной микроглии. Следовательно, на продромальной стадии болезни Альцгеймера сначала происходит изменение синаптической функции нейронов. В дальнейшем исследователи намерены выяснить, как на активность DEK влияет накопление амилоидов, а также старение. Они также заинтересованы в изучении влияния генетических вариаций DEK, так как в литературе есть данные о том, что однонуклеотидный полиморфизм в интроне гена DEK, rs145578678, ассоциирован со скоростью снижения когнитивных способностей при болезни Альцгеймера.

Развитию болезни Альцгеймера способствуют реактивные астроциты