Вирусный вектор на основе бактериофага T4 доставляет ДНК, РНК и белки

Вирусы — высокоэффективные молекулярные машины, способные к репликации. Ученые многократно использовали свойства вирусов для создания искусственных вирусных векторов (ИВВ), доставляющих полезный груз к клеткам. В частности, ИВВ делали на основе аденоассоциированных вирусов и лентивирусов. Однако у них есть недостатки, например, небольшая емкость. К тому же эти векторы заражают многие клетки, иммуногенны и интегрируют груз в геном клетки-хозяина.

Фаг Т4 (семейство Straboviridae) заражает бактерию Escherichia coli. Его капсид содержит дцДНК размером 171 тыс. п.н. Фаг Т4 хорошо изучен, его молекулярная архитектура и генетические и биохимические механизмы сборки известны. Кроме того, для этого бактериофага разработаны методологии упаковки чужеродных белков и ДНК в капсид.

В новой работе исследователи из США предложили использовать бактериофаг Т4 для доставки полезного груза — нуклеиновых кислот и белков — в клетки человека .

Сборка вирусного вектора осуществляется путем последовательного введения очищенных биоматериалов. Капсид заполняли чужеродной ДНК, добавляя линеаризованные плазмиды и АТФ. На поверхности вирусной частицы располагаются белки Soc и Hoc — ключевые факторы стабилизации капсида и прикрепления к клетке-хозяина. Сверху конструкцию покрывали катионными липидами. Серия экспериментов подтвердила, что именно катионные липиды позволяли вектору на основе фага Т4 связываться с отрицательно заряженной и липофильной мембраной клеток человека.

Большой объем капсида фага Т4 позволяет осуществлять одновременную доставку нескольких генов и белков в клетку человека. Авторы подтвердили вместимость вектора, упаковав в него ген дистрофина. После этого они показали, что груз вектора можно использовать для редактирования генома. С этой целью был выбран терапевтически значимый сайт — ген бета-гемоглобина (HBB) на 11-й хромосоме человека. Работа была проведена на клеточной линии HEK293T (эмбриональная почка человека). Конструкция, представляющая собой комплекс Cas9-HBB гидРНК, успешно выполнила редактирование 20–25% клеток. Кроме того, был получен вектор, с помощью которого можно выполнить одновременное редактирование в двух разных, не связанных между собой участках генома.

В исследовании был продемонстрирован широкий спектр молекул, который может быть включен в ИВВ. К ним относятся белки размером от 27 до 516 кДа, нуклеиновые кислоты от 100 п.н. до 20–40 т.п.н., РНК-белковые, ДНК-белковые, белок-белковые комплексы.

 Структурная модель искусственного вирусного вектора на основе бактериофага Т4. ДНК, белки, РНК и их комплексы включены в оболочку капсида Т4 размером 120 x 86 нм. Credit: Venigalla B. Rao; Victor Padilla-Sanchez, Andrei Fokine, and Jingen Zhu

Эффективность доставки ИВВ на базе Т4 в клетки человека измеряли по экспрессии репортерных генов (Luci, GFP, mCherry) или на основе функциональной активности доставляемого белка (β-Gal, Cre и Cas9). Использование липофильной оболочки позволило значительно увеличить трансдукцию, а также стабилизировало частицы. Они оставались стабильными при температуре +4ºC не менее четырех недель без существенных потерь ДНК.

Белок BstA профага защищает сальмонеллу от других фагов