Вирусоподобные частицы без ДНК для генной терапии

В существующих вариантах генной терапии применяются аденоассоциированные вирусы или липидные наночастицы, несущие мРНК. Гидовая РНК и редактирующий белок экспрессируются в клетке в избыточном количестве, и это повышает риск нецелевого редактирования генома. Кроме того, при использовании вирусов для генной терапии сохраняется определенный риск: вирусная ДНК может встроиться в геном хозяина и вызвать онкогенное перерождение. Исследователи из Института Бродов под руководством Дэвида Лю с коллегами из Калифорнийского университета в Ирвине и Медицинской школы Перельмана в Университете Пенсильвании предлагают снизить эти риски, используя для генной терапии вирусоподобные частицы, не содержащие ДНК, а несущие в себе готовые инструменты для редактирования — белок-редактор оснований и гидовую РНК.

Редакторы оснований — генетические инструменты на основе модифицированного Cas9 белка, которые позволяют производить однонуклеотидные замены в геноме без внесения разрыва в ДНК. По сравнению с CRISPR-Cas9 этот методе снижает вероятность образования случайных делеций и вставок, а потому он предпочтителен в тех случаях, когда генетическое редактирование в генной терапии подразумевает исправление точечной мутации.

Исследователи собирали компоненты системы редактора оснований в клетках линии HEK293T в вирусоподобную частицу на основе ретровирусов, а затем использовали такие готовые частицы для редактирования клеток ex vivo и in vivo. Последовательность редактора оснований слита с последовательностью вирусного белка MLV, это обеспечивает упаковку целевого белка в комплексе с гидовой РНК в вирусный капсид. Специфичность вирусоподобных частиц к определенному типу клеток достигается за счет использования разных упаковочных гликопротеинов.

Главная проблема, с которой столкнулись авторы, — упаковка вирусоподобных частиц и редактирование ДНК в целевых клетках выдвигают различные требования к клеточной локализации белка-редактора оснований. Для успешного редактирования желательно, чтобы редактор оснований обладал последовательностью ядерной локализации, но при ядерной локализации невозможна упаковка белка в вирусоподобную частицу.

Авторы применили для решения этой проблемы двойную систему локализации. К последовательности вирусного белка добавили сигнал экспорта из ядра, а последовательность редактора оснований фланкировали сигналами ядерной локализации. Между ними находится сайт разрезания протеазой, которая включена в состав вирусоподобной частицы. Таким образом, сборка частицы производится в цитоплазме, а в целевой клетке отщепленный фрагмент редактора оснований, несущий сигналы ядерной локализации, направляется в ядро.

Систему проверили на клетках HEK293T, при этом эффективность редактирования была сопоставима с той, что была достигнута при обычной трансфекции, но частота нецелевого редактирования была снижена в 12-900 раз. Эффективность редактирования первичных клеточных культур также была близка к 100%, нецелевое редактирование тоже было относительно редким.

При инъекции вирусоподобных частиц в спинномозговую жидкость новорожденных мышей эффективность редактирования гена Dnmt1 в клетках объемной коры и среднего мозга составила 6,1% и 4,4% соответственно. При редактировании терапевтически значимого гена Pcsk9 в клетках печени взрослой мыши эффективность достигла 63% —  результат, сравнимый с альтернативными подходами, и при этом уровень нецелевого редактирования оказался недетектируемым.

Также авторы применили новый подход для лечения мышей с моделью генетически обусловленной слепоты, вызванной мутацией в гене Rpe65 (врожденного амавроза Лебера). Эффективность редактирования составила 12%, и после единственной инъекции зрение у животных частично восстановилось.

В качестве возможного ограничения метода авторы называют нецелевой захват случайных компонентов клетки в состав вирусоподобной частицы, что может повлечь сложно предсказуемые риски.