Максим Шкурников: «После СOVID-19 люди возвращаются к своим рутинным исследованиям»

Текст создан в рамках проекта «Завлабы»: редакция PCR.NEWS задает вопросы руководителям лабораторий, отделов и научных групп. Что бы вы сделали, если бы были всемогущи? Как должен выглядеть идеальный мир через 50 лет? Что вам не дает покоя? Какому главному правилу вы можете научить начинающих исследователей? И так далее.

Азарт постоянно испытываю, потому что мы всегда занимаемся очень интересными проектами. Сейчас это создание платформы для исследования старения на основе сокультивирования клеточных моделей органов и тканей в микрофлюидных чипах. Самый простой чип состоит из двух лунок, соединенных каналом, под которыми циркулирует культуральная жидкость. Она обеспечивает коммуникацию между двумя популяциями клеток. Например, в одну лунку помещен монослой клеток кишечника, обеспечивающий барьерную функцию, сверху мы добавляем препарат, который предполагается применять перорально. Он или не проникает через кишечный барьер, или проникает и воздействует на клеточную модель печени, находящуюся в соседней лунке. Там происходит метаболизм препарата и появляются вторичные метаболиты.

Мы сами изготавливаем такие чипы, сами разрабатываем клеточные модели, стараемся их стандартизировать, потому что необходимо обеспечить воспроизводимость результатов. Сейчас мы используем опухолевые клеточные линии, они позволяют получать воспроизводимые результаты. Кроме того, мы работаем с первичными культурами, полученными из опухолей пациентов. Такой подход дает возможность оценить чувствительность опухоли к химиотерапии.

Я очень люблю макрофаги. Есть замечательная линия моноцитов THP1, мы получаем из нее М0 — наивные макрофаги, потом, допустим, М1 — провоспалительные или М2 — противовоспалительные макрофаги. А дальше — самое интересное начинается. Мы моделируем в них старение посредством наработки в этих клетках несвернутых белков. Добавляем растительный лектин вискумин, который содержится в омеле белой. Он останавливает белковый синтез — повреждает рибосомы во время трансляции мРНК. В результате рибосома «застревает» на молекуле мРНК, не закончив синтез белковой молекулы. Это вызывает стресс несвернутых белков. Мы можем дозированно повреждать известное количество рибосом — один, два, три, четыре процента. Сейчас мы сделали большой эксперимент, где взяли М0, М1, М2 макрофаги и обработали их различными дозами вискумина. Что самое интересное? После анализа результата секвенирования мы увидели, как в макрофагах последовательно включаются каскады факторов транскрипции, которые отвечают за защиту клетки от несвернутых белков. Видно, как в случае повреждения 1% рибосом включился классический ATF4 механизм, а дальше, когда много несвернутых белков, включаются воспалительный, апоптозный каскады.

Гордость связана прежде всего с нашей работой в эпоху СOVID-19. Мы разработали прекрасный алгоритм прогноза рисков развития тяжелой формы СOVID-19. Он был построен целиком на молекулярных данных. Мы анализировали генотип человека, определяли особенности его главного комплекса гистосовместимости первого класса, моделировали взаимодействие молекул главного комплекса с пептидами вируса SARS-CoV-2, вызывающего СOVID-19. Нами был разработан портал T-cell COVID-19 Atlas, который облегчает исследователям доступ к информации об аффинности взаимодействия пептидов различных вариантов SARS-CoV-2 с наиболее часто встречающимися вариантами молекул главного комплекса гистосовместимости. Эта информация необходима для того, чтобы понять, как эффективно макрофаги человека могут демонстрировать T-лимфоцитам антигены вируса. Если макрофаги адекватно их презентируют, то обычно болезнь протекает легко. Если нет, то человек практически беззащитен перед вирусом первые две недели заболевания, пока не разовьются нейтрализующие антитела. У него работает врожденный иммунитет и формируется гуморальный, но фактически отсутствует клеточный. Мы показали эффективность нашего алгоритма и в первую волну, и в третью волну СOVID-19.

Меня не перестает радовать, что после того, как все были переориентированы на СOVID-19, люди возвращаются к своим рутинным исследованиям. Работают в тканевой инженерии, моделировании процессов старения. Мы не занимаемся старением как таковым, скорее разбираемся, как остановить хроническое низкоинтенсивное воспаление. [О связи хронического стерильного воспаления со старением на PCR.NEWS.] Большое место в работе нашей лаборатории занимает онкология — как вовремя диагностировать и предотвратить развитие болезни. И создание моделей, на которых можно изучать старение человека в чипе.

У меня нет таких проблем организационного плана, от которых я хотел бы избавиться. В ВШЭ прекрасно отлажено административное обеспечение научных исследований. Многим хотелось бы освободиться от бюрократии, но без нее не было бы защитных механизмов между энтузиазмом ученых и людьми. Необходимо понимать, что организационные ограничения несут функциональную нагрузку и помогают правильно строить работу. Например, четко регламентированные клинические испытания нужны для обеспечения безопасности пациентов. Если говорить о глобальном финансировании научных исследований, то разные мнения имеют право на жизнь. Хочется отметить, что у нас в НИУ ВШЭ есть прекрасная внутренняя программа финансирования науки. Не все темы научных исследований перспективны, и не все имеет смысл финансировать. Разумный баланс должен быть.

Общение с зарубежными коллегами не усложнилось. Стало проблемнее ездить в гости к европейским коллегам, но личное общение осталось. Тяжелее получить билатеральные проекты, и это осложнило совместную работу. Фактически, мы сейчас параллельно живем, не пересекаемся. Публикации у нас есть с китайскими коллегами, активно развивается сотрудничество с Индией.

Беспокоит доступ к реагентам и расходным материалам. Когда я пришел в НИУ ВШЭ, фактически меня позвали основать лабораторию, и у меня были деньги на ее оснащение. Я оборудовал ее с учетом текущих реалий, в основном китайским оборудованием. Но сейчас есть проблема с покупкой реагентов даже для китайского оборудования. Китайские реагенты для секвенирования не дешевле, чем у Illumina, хотя протоколы у них менее отработаны. Сейчас больше cтало поставщиков реагентов, но есть свои проблемы. Если раньше у меня были реагенты через два-три месяца после заказа, то сейчас это может и полгода занять, и то оптимистично. С другой стороны, мы начали изучать отечественный рынок, и приятно осознавать, что производство ряда реагентов уже локализовано.

Из личных целей — создать микрофлюидную модель для доклинических испытаний, для скрининговых испытаний лекарственных препаратов. Скорее всего, это будет сначала дополнением к мышке, потом это должно будет заменить мышку.

Я начал работать с микрофлюидикой в 2011 году, с тех пор она не получила большого распространения в реальном секторе экономики, а прошло уже больше 10 лет. Есть около пяти групп в мире, которые активно работают над внедрением микрофлюидных моделей в практику. Это фундаментальные исследования, они начинались с большим энтузиазмом на волне инициатив ЕС по замене животных моделей на клеточные. С тех пор не так много моделей было одобрено для проведения доклинических исследований. Работы продолжаются, но они вышли на плато.

Думаю, что проблема внедрения релевантных микрофлюидных моделей лежит в плоскости обеспечения стабильного взаимодействия нескольких клеточных популяций. Можно создать условия для сосуществования двух-трех, не больше, потому что одной популяции нужны одни факторы роста, другой — другие, и иногда это взаимоисключающие факторы. Сейчас как раз идет работа по накоплению опыта в этой области: как сокультивировать клетки длительное время. Надо обеспечить их сосуществование не несколько суток, а желательно до месяца, – это нелегко.

Уже ведутся работы по созданию микрофлюидного «мозга на чипе». На текущий момент это двумерные и трехмерные сети из нескольких сотен нейронов со сформированными синаптическими связями. Эти модели поддаются обучению. Они гораздо энергоэффективнее, чем кремниевые ЭВМ, в задачах распознавания образов.

Второе направление наших исследований — изучение биологической роли микроРНК. Впервые мы столкнулись с ними в 2011 году, когда изучали влияние интенсивных нагрузок на высококвалифицированных спортсменов. Тогда мы впервые обнаружили значительные изменения в профиле циркулирующих в плазме крови микроРНК.

Сначала я занимался построением прогностических тест-систем на основе циркулирующих в сыворотке и плазме крови микроРНК. МикроРНК очень удобны для этих целей, так как очень стабильны. После этого перешел к вопросу: а могут ли микроРНК в организме человека выполнять функциональную роль, быть не только отголосками каких-то событий? Сейчас мы пришли к пониманию, что, скорее всего, микроРНК имеют функциональную активность в межклеточных взаимодействиях, но на очень коротком промежутке — две-три клетки, там, где микровезикулы в значимых концентрациях могут переходить от одной клетки к другой.

Потом мы перешли к изучению биогенеза этих молекул. МикроРНК посттранскрипционно регулируют экспрессию практически всех генов в нашем организме за счет комплементарного связывания с молекулами мРНК и подавления их трансляции. Процесс образования микроРНК включает несколько этапов. На первом этапе в результате транскрипции образуется молекула при-микроРНК, имеющая структуру шпильки. Затем два фермента, Drosha и Dicer, последовательно вырезают из при- и пре-микроРНК зрелую микроРНК длиной около 22 нуклеотидов. Неточность работы этих ферментов приводит к образованию изоформ микроРНК — молекул, отличающихся от канонической микроРНК на 1–3 нуклеотида с концов последовательности. Важность этих молекул заключается в том, что неканоническая изоформа микроРНК обладает отличным от канонического варианта списком мишеней.

Мы продемонстрировали важную роль изоформ микроРНК в канцерогенезе. Они независимо от канонической формы регулируют активность генов-мишеней. Доступ к результатам этих исследований предоставляет наш информационный портал isomiRTar. Кроме того, наша научная группа под руководством члена-корреспондента РАН Александра Григорьевича Тоневицкого выявила мотив у основания петли пре-микроРНК, который способствует более точному положению разрезания микроРНК ферментом Dicer. Этот мотив был экспериментально подтвержден работой южнокорейской группы, опубликованной в феврале 2023 года в журнале Nature. Они назвали его GYM-мотивом. Дальнейшие наши исследования показали, что в отсутствии GYM-мотива Dicer определяет положение разрезания, преимущественно отмеряя 22 нуклеотида с 3’-конца 3р-плеча shRNA. Такой механизм принято называть «молекулярная линейка».

Сложно заглядывать на 50 лет вперед. Но есть ключевые моменты: автоматизация работы лабораторий, наличие валидированных моделей процессов в организме человека на основе технологий «человек на чипе», наличие биоинформатического аппарата для совместного анализа больших объемов данных разных типов. Поясню. Уже сейчас мы анализируем одновременно и мРНК, и микроРНК, и протеом. Но подобные данные тяжело анализировать совместно, находить взаимосвязи. Я думаю, что через пять-десять лет разработают инструментарий для совместного анализа разнородных данных, и мы сможем увидеть цепочку событий от взаимодействия рецептора с лигандом до активации фактора транскрипции.

Я сейчас ожидаю скорее эволюционное развитие, чем революционное. Наверное, в первую очередь это глубокое понимание процессов регуляции нашей иммунной системы. СOVID-19 дал огромный массив данных по изучению иммунитета и особенностям его формирования. Сейчас идет трансляция этих знаний в онкологию, прежде всего в область исследований неоантигенов, в понимание того, как это применять для лечения злокачественных новообразований. В изучении процессов старения эти данные тоже могут найти применение, потому что в стареющей клетке меняется механизм сплайсинга, нарушается процесс свертывания белков, возможно, появляются неоантигены, которые могут быть использованы для своевременного удаления из организма человека клеток со старческим фенотипом.

Данные, полученные в молекулярно-биологических исследованиях, унифицированы и всегда выглядят абсолютно одинаково. Совершенно иная ситуация с информацией о фенотипе образца. Если это информация о пациенте, то не всегда известно о предшествующем лечении, о его эффективности, сопутствующих заболеваниях и т.д. Если в статье описан эксперимент с клеточной линией, то очень редко указывается, на каком пассаже взята клеточная линия. Это не дает понять, насколько чужие данные сопоставимы с нашими. Мы всегда анализируем и свои, и чужие данные, стараемся найти подтверждение тому, что мы все сделали правильно и получили что-то новое. Никогда не анализируем в отрыве от опубликованных данных.

Тем, кто сейчас начинает, очень простой совет: не увлекаться биоинформатикой, а учить первоосновы. Надо понимать прежде всего, что́ ты анализируешь. Это позволит не совершить огромное количество ошибок. Сейчас идет бурное развитие биоинформатики, многие молодые ученые увлекаются новыми инструментами и часто забывают об изучении уже существующего объема исследований. В результате абсолютно не понимают, что они смотрят, как это работает и что потом с этим делать.

Беседовала Анастасия Полтавец