erid:2VfnxxPDTVb

Sequencing by Expansion (SBX): Механизм, отличие от других технологий и перспективы применения

Компания Roche собирается вывести на рынок AXELIOS — новую платформу секвенирования, которая имеет принципиальные отличия от всех существующих платформ. О ней было объявлено в феврале 2025 года, но разработка заняла более 10 лет. Технология получила название sequencing by expansion (SBX).

Суть ее в следующем: фрагмент ДНК, который нужно секвенировать, выступает в роли матрицы, на которой синтезируется другая молекула, намного более крупная. Для этого необходимы мономеры необычного строения — X-NTP, очень отдаленно похожие на «нормальные» нуклеотиды. X-NTP можно описать как нуклеотидтрифосфаты, к которым прикреплены длинные, сложенные в виде шпильки полимерные молекулы из полиэтиленгликоля и фосфатных групп, с объемной разветвленной группой в средней части (см. рисунок). Таких полимерных молекул четыре, для каждого нуклеотида своя, и они отличаются «толщиной».

Полученная полимерная молекула (Xpandomer, или Xp, произносится «экспандомер») имеет вид ершика. Однако после того, как в каждом X-NTP разрывается связь между дезоксирибозой и фосфатом, шпильки могут распрямиться, и молекула экспандомера становится линейной. Полимерные участки четырех типов в ней чередуются в той же последовательности, что и нуклеотиды в молекуле ДНК.

Готовый экспандомер проходит через нанопору. Он примерно в 50 раз длиннее исходной ДНК, а строение полимерных участков обеспечивает существенное различие в уровнях ионного тока для каждого нуклеотида. Все это облегчает интерпретацию измерений тока, и вероятность ошибок при чтении существенно снижается. Сами разработчики назвали это «химической амплификацией сигнала».

Таким образом, SBX — это одновременно и секвенирование путем синтеза, и нанопоровое секвенирование. Основные преимущества, заявленные компанией Roche, — высокая точность в сочетании с высокой скоростью и производительностью.

   Мономер для синтеза экспандомеров — X-NTP (на примере цитидинтрифосфата). «Когда вы видите структуру X-NTP, вы, вероятно, думаете: это безумие!» — говорит Марк Кокорис, один из создателей технологии. Источник:  Roche  

   Чтобы синтезировать экспандомер на матрице ДНК из вашей библиотеки, нужны X-NTP четырех типов, способная работать с ними полимераза и другие реагенты, а также специальный чип. Источник:  Roche   

  Транслокация экспандомера через пору позволяет получить легко интерпретируемый график ионного тока. Источник:  Roche   

Авторы разработки опубликовали препринт статьи с детальным описанием SBX на biorXiv. Подробнее о технологии на русском языке можно прочитать на PCR.NEWS.

За пределами рекорда: для каких задач важны преимущества SBX

Roche уже объявила, что ее метод попал в Книгу рекордов Гиннесса. Сотрудники Детской больницы Бостона, Broad Clinical Labs и Roche Sequencing Solutions опубликовали в NEJM сообщение о рекордно быстром прочтении геномов человека.

Авторы сообщения секвенировали с помощью SBX семь клинических геномов детей в отделении интенсивной терапии новорожденных, а также еще пять секвенированных ранее геномов пациентов. В геноме одного из детей была выявлена транслокация, в геноме другого — мутация в гене. Среднее время от начала экстракции ДНК до секвенирования и первичного анализа данных составило 4 часа 4 минуты, тогда как предыдущий рекорд — 5 часов 2 мин. Время улучшено на час, причем рекорд достигнут в реальных клинических условиях.

Идея авторов в том, что время до получения ответа о наличии патогенных вариантов может быть критично. Генетические нарушения — ведущая причина смертей новорожденных в отделениях интенсивной терапии, и выигранные часы в некоторых ситуациях спасают жизни.

  По мнению разработчиков, SBX найдет применение и в других областях медицины. Например, в онкологии, где у пациента тоже может быть мало времени. Источник:  Roche   

Таким образом, потенциальные области использования sequencing by expansion — те, где необходимо получить большой объем качественной генетической информации как можно быстрее. Скорее всего, это некоторые специфические области медицины и фундаментальной науки.

Технические характеристики SBX.

• Гибкость. Есть возможность мультиплексирования, параллельного секвенирования, отслеживания накопления и анализа данных в реальном времени. Кроме того, есть возможность остановить секвенирование, когда данных получено достаточно.

• Точность. Заявлена Q-score 22–26 для «простых» однонитевых ридов и 38–39 для дуплексных. Это выше, чем у нанопорового секвенирования, и близко к классическому NGS.

  Стоит отметить, что дуплексные риды в SBX не совсем привычные — они получаются из шпилек. Источник:  Roche   

• Производительность и скорость. Производительность действительно огромная — около терабазы за час, то есть геном человека можно секвенировать за часы. С чем из привычных технологий это можно сравнить?

— Терабазу оснований дадут 6–12 ячеек PromethION и только за свой полный ресурс работы (2-3 дня параллельно) с хорошей библиотекой, — объясняет Сергей Евфратов. — Но для многих пользователей это минус. Им часто не нужно много, им нужно мало.

• Длина ридов. Сотни — пара тысяч пар оснований, то есть больше, чем у NGS второго поколения, но значительно меньше, чем достижимые в настоящее время многие десятки тысяч на Oxford Nanopore Technologies (ONT) или 15 тысяч для Pacific Biosciences (PacBio).

• Соотношение эффективности и цены. По цене все еще нет информации. Но очевидно, что приборы, реагенты и расходные материалы для SBХ не могут быть дешевыми.

  Источник:  Roche   

Сколько стоит SBX

Была названа цена прибора — 750 тысяч долларов. Другие расходы можно оценить лишь примерно, из общих соображений.

Подготовка библиотеки, очевидно, происходит приблизительно так же, как в NGS второго поколения — предварительная подготовка, фрагментация, присоединение адапторов. Но дальнейшие этапы сильно отличаются от всего, что знакомо специалистам.

Прежде всего, для SBX нужны два чипа: для синтеза экспандомеров на матрице ДНК и для самого нанопорового секвенирования.

Твердофазный синтез экспандомеров — сложный процесс, в котором используются специфические продукты, такие как мономеры X-NTP или специально созданная полимераза, который может с ними работать. Для их получения требуется уникальная по сложности химия, и очевидно, что продукт должен иметь высокую себестоимость.

При этом нигде не упоминается, что реагенты можно дозировать пропорционально количеству синтезируемых молекул. Скорее всего, количество требуемых реагентов на целый чип или дорожку чипа будет фиксированным, как и затраты на этапе синтеза.

Секвенирующий чип — по сути, ультрамногоканальный пикоамперметр, похожий на чипы ONT. Сообщается, что чип для SBX несет около 8 млн каналов, то есть на несколько порядков больше, чем у ONT (сотни либо тысячи). Следовательно, если скорость секвенирования сопоставимая, то и скорость выдачи данных на три порядка больше.

Ключевая особенность секвенирующего чипа SBX: в отличие от чипов ONT, он «голый», мембрану и нанопоры наносят на него при старте. Таким образом, за эти реагенты в каждом цикле придется платить дополнительно.

Есть указания на то, что поры Roche быстро выходят из строя, возможно, быстрее, чем у ONT,

  Секвенированию предшествует нанесение мембраны и пор на чип, а после секвенирования их удаляют. Источник:  Roche  

Информации о цене реагентов, чипов или цене за определенный шаг нет. Также нет информации по глубине мультиплекса. Возможно, пока и сами производители не знают точно, сколько это будет стоить после перехода к серийному производству. Есть слухи про 40–60 долларов за геном, но они пока ничем не подтверждены. По приблизительным подсчетам, запуск может стоить как минимум тысячи долларов.

  Еще немного технических данных. Источник:  Roche

Кому действительно нужен SBX?

— Это очередной очень дорогой «завод для секвенирования», который дает вагон данных быстро, но стоит как завод, и запустить его тоже будет стоить — как запустить завод, — говорит Сергей Евфратов. — Преимущества завязаны на эффекте масштаба и скорости: очень дорогой запуск даст много данных быстро, в итоге себестоимость нуклеотида или образца маленькая, потому что нуклеотидов и образцов будет много.

Мы помним, что всегда есть выбор из трех опций: «дешево», «хорошо», «быстро». В данном случае получаем «хорошо» и «быстро». Но точно дорого. Пусть даже себестоимость буквы низкая, запуск может быть только очень дорогим.

Когда появился Oxford Nanopore, это была абсолютно противоположная ситуация, предложение для совершенно других пользователей. Очень низкий порог входа: технологию могли купить в том числе те, у кого относительно мало денег и кому нужно было секвенировать немного. А SBX от компании Roche — это очень высокий порог входа и очень дорогое, мощное и качественное секвенирование. Области применения — может быть, медицинская геномика, в том виде, в каком применение описано в NEJM. Представители компании также говорят о транскриптомике и совместимости их платформы с технологиями 10x Genomics — в этом случае длина ридов SBX достаточна для практически полного прочтения всей длины транскриптов.

С другой стороны, не будет преимуществ нанопорового секвенирования — длинных ридов, возможности прямого чтения и получения данных по эпигенетическим модификациям. Существенно увеличить длину ридов им вряд ли удастся, поскольку возможности твердофазного синтеза ограничены. Какое-то решение по эпигенетическим модификациям, вероятно, со временем появится.

В любом случае это скорее нишевое применение, поскольку клиентов, которым действительно очень нужно столько информации в короткое время, не так много. И в принципе такого же результата можно достичь на тех приборах, что уже есть на рынке, вопрос только в том, зачем. Это как сделать самый большой поезд в мире поезд или самый грузоподъемный лифт: кому-то они действительно очень нужны, но большинству нужны привычные грузовые составы и офисные лифты.

Дополнительные источники информации

Вебинар Roche про технологию SBX и ее применение

Неофициальные публикации в профильных блогах:

ASeq Newsletter

Omics! Omics!

Реклама. Рекламодатель ООО «СКАЙДЖИН» ИНН 7705997147