ДНК крупным шрифтом: Roche готовит запуск новой платформы для нанопорового секвенирования

На вебинаре в прошлый четверг компания Roche представила информацию о своей технологии нанопорового секвенирования Sequencing-by-Expansion (SBX). Запуск платформы, которая разрабатывалась более десяти лет, запланирован на 2026 год.

В мае 2020 года Roche заявила о приобретении компании Stratos Genomics из Сиэтла, которая разрабатывает технологию нанопорового секвенирования SBX. Ранее, в 2014 году, Roche инвестировала 5 млн долларов в Stratos для разработки химии SBX, и затем еще 10 млн долларов, когда Stratos достигла «определенных технических вех». В том же 2014 году Roche приобрела компанию Genia за 350 миллионов долларов, ее полупроводниковый чип наряду с химией SBX лег в основу новой платформы, сказал в интервью GenomeWeb Марк Кокорис, глава Roche по SBX и соучредитель Stratos. Химия SBX — изобретение Кокориса и другого соучредителя Stratos Роберта Макруэра.

«Наш подход к эффективному секвенированию ДНК заключается в том, чтобы не секвенировать ДНК», — объяснил Кокорис порталу Genetic Engineering & Biotechnology News (GEN). Действительно, этапу нанопорового секвенирования предшествует этап синтеза: на матрице ДНК-мишени строится молекула, которая уже не является ДНК и примерно в 50 раз длиннее матрицы. Разработчики назвали ее Xpandomer (икспандомер, Xp). В нанопору проходит именно она.

Технология SBX подробно описана в препринте, опубликованном на сервисе BioRxiv 24 февраля.

При «классическом» нанопоровом секвенировании отрицательно заряженная молекула ДНК или РНК проходит через пору в мембране, разделяющую два резервуара с раствором, — из резервуара с отрицательным потенциалом в резервуар с положительным. При этом можно зарегистрировать изменения тока, так как нуклеотиды блокируют перемещение ионов через пору. Анализ этих изменений позволяет восстановить последовательность нуклеотидов. Однако различия в геометрии нуклеотидов не очень велики, поэтому точность секвенирования с самого начала была слабым местом нанопора. Отсюда возникла идея заменить нуклеотиды на что-то другое.

При подготовке к SBX-секвенированию ДНК-матрица гибридизуется с праймером, который входит в состав специальной молекулы (expanded oligo, EO), закрепленной на твердой подложке чипа. Затем высокоинженерная ДНК-полимераза (Xp-синтаза) удлиняет праймер и строит комплементарную цепь, но не из обычных нуклеотидов, а из X-NTP. Представьте себе нуклеотидтрифосфат, к которому прикреплена в двух точках (к первой фосфатной группе и азотистому основанию) сложенная в виде шпильки полимерная молекула, состоящая из полиэтиленгликоля и фосфатных групп. (К каждому из четырех нуклеотидов прикрепляется свой полимерный участок с характерным строением.) На верхушке шпильки находится объемная боковая группа — разветвленная структура, которая называется «элемент контроля трансляции» (TCE).

Важная подробность: в нуклеотиде X-NTP атом кислорода между остатком дезоксирибозы и первой фосфатной группой заменен на NH-группу. Связь между азотом и фосфором может быть расщеплена кислотой, при этом цикл разомкнется.

Марк Кокорис признает, что «когда вы видите структуру X-NTP, вы, вероятно, думаете: это безумие!» Одиннадцать лет назад было непонятно, как создать необходимую химию, в том числе расщепляемые X-NTP и полимеразу, которая могла бы с ними работать. «И я знал, что это потребует инноваций в белковой инженерии, молекулярной инженерии, разработке химии, которой не существовало. И было много других вещей, о которых мы не знали в то время, и которые нам нужно было внедрить».

В итоге на матрице синтезируется молекула, имеющая вид «ламповой щетки» — с боковыми петлями полимеров на каждом нуклеотиде. Это и есть Xpandomer. Фоторасщепление ЕО по определенному сайту высвобождает продукт, а обработка кислотой расщепляет X-NTP. При разрывании циклов образуется линейная полимерная последовательность, в которой чередуются полимерные фрагменты четырех типов, в соответствии с последовательностью нуклеотидов ДНК-матрицы.

Молекулу Xp нужно направить в пору на мембране. Этому способствует структура ЕО, включающая гидрофобный участок, которые контактирует с мембраной, и участок, несущий большое количество отрицательных зарядов. И тут в полной мере выявляется преимущество новой технологии. Полимерные участки, из которых состоит Xpandomer (авторы назвали их Symmetrically Synthesized Reporter Tethers, или SSRT), отличаются «толщиной» за счет различного количества боковых групп. Поэтому и уровни снижения тока в нанопоре различаются сильно и четко. Кроме того, TCE — разветвленная группа в каждом SSRT — настолько велика, что задерживает молекулу в поре на время, достаточное, чтобы зафиксировать изменения тока. Группы TCE последовательно «протаскивают» через пору регулярными короткими импульсами повышенного напряжения на электродах. Все это делает процесс высококонтролируемым и облегчает интерпретацию измерений ионного тока. Решается ключевая проблема соотношения «сигнал-шум»

Для сборки этих сложных молекул разработчики использовали подходы клик-химии. Фермент Xp-синтаза был получен из ДНК-полимеразы Dpo4 термофильной археи Sulfolobus solfataricus, которая изначально могла работать с объемными структурами вместо обычных тринуклеотидов. После замены 36 аминокислот она смогла синтезировать Xp длиной в сотни «нуклеотидов». Для улучшения синтеза в состав SSRT ввели положительно заряженные участки — энхансеры (перед прохождением через пору положительные заряды, конечно, приходится нейтрализовать). Кроме того, длину прочтений увеличивает специально сконструированный кофактор — Polymerase Enhancing Moiety (PEM).

На вебинаре Марк Кокорис сделал обзор инструментов для SBX — прибора для синтеза Xp и собственно секвенатора SBX.

Платформа синтеза направляет реагенты на так называемый чип XP, где Xpandomers производятся путем твердофазного синтеза. Что касается секвенирования, Кокорис сообщил, что для каждого цикла создается липидный бислой со встроенными белковыми нанопорами. Обычно используется около 7–7,5 миллионов функционирующих пор из 8 млн за один запуск. Сенсорный модуль после запуска можно использовать повторно.

Кокорис отказался подробно рассказывать о конструкции нанопор Roche, за исключением того, что у компании есть «собственная пора» для SBX-секвенирования. Он также отказался комментировать, есть ли что-то общее у белковых нанопор Roche и с нанопорами Oxford Nanopore Technologies, которая в значительной мере контролирует интеллектуальную собственность в этой области. В препринте упоминаются альфа-гемолизиновые нанопоры.

Кокорис упомянул два режима SBX-секвенирования: симплексный, со «сверхвысокой» пропускной способностью, и дуплексный, с повышенной точностью. Для дуплексного секвенирования SBX к ДНК-матрице во время подготовки библиотеки добавляется шпилечный адаптер в форме Y, что приводит к образованию Xp, содержащего обе родительские цепи исходной молекулы.

Подготовка дуплексной библиотеки требует 20–50 нг нефрагментированной геномной ДНК или 2,5–10 нг бесклеточной ДНК, хотя Кокорис сказал, что это количество может быть уменьшено. Дуплексная библиотека создается с использованием линейной амплификации, а не ПЦР-амплификации, чтобы повысить точность для гомополимерных инделов.

При секвенировании геномов клеток HG001 в качестве контрольного образца качество дуплексного полногеномного SBX секвенирования достигло Q39, с оценками F-1 99,8% для однонуклеотидных вариантов и 99,56% для инделов.

В эксперименте по секвенированию семи образцов Genome in a Bottle (GIAB) производительность достигла 5,3 миллиарда дуплексных считываний в час, причем для всех образцов было получено покрытие от 34X до 38X.

Помимо скорости и пропускной способности, представители Roche подчеркнула гибкую масштабируемость SBX и возможность анализа данных в реальном времени.

Длины ридов, как сообщалось на вебинаре, составляют 150–350 пар оснований для дуплексного секвенирования и от 200 до более 1000 — для симплексного секвенирования, т.е. они достаточно короткие.

Ключевой вопрос — обнаружение эпигенетических сигнатур. Например, технология Oxford Nanopore позволяет выявлять эпигенетические модификации нуклеотидов, а синтез Xp, очевидно, не даст такой возможности. Однако Марк Кокорис, отвечая на этот вопрос, сказал, что технология «совместима со всеми конверсионными химиями», и команда работает над решением вопроса об оптимизации дуплексного или симплексного секвенирования для таких анализов.

Кроме того, Кокорис подчеркнул, что рабочий процесс SBX совместим с автоматизацией и пользователи могут преобразовать для этой технологии свои библиотеки Illumina.

Roche уже предоставила платформы SBX двум партнеров раннего доступа: Hartwig Medical Foundation в Нидерландах и Институту Бродов. Компания продолжит работать с этими партнерами в течение 2025 года; предполагается, что программа раннего доступа будет расширена. После этого Roche планирует выпустить платформу SBX как продукт для научных исследований в 2026 году.

Ландшафт NGS сильно изменился за десять лет, с тех пор, как Roche приобрела Genia и Stratos, отмечает GenomeWeb. Помимо Oxford Nanopore и Pacific Biosciences, которые продолжают повышать точность и производительность своего секвенирования и снижать стоимость продуктов, такие игроки, как Illumina, стремятся увеличить длину считывания. Кроме того, на рынок нанопорового секвенирования выходят китайская BGI Group и AxBio, которая ведет операции в США и Китае.

Roche отказалась раскрыть стоимость SBX во время вебинара. Кокорис отметил, что компания стремится сделать технологию эффективной и конкурентоспособной по цене.

Метод smol-seq использует ДНК-аптамеры для количественной метаболомики