Потеря хромосомы при редактировании генома Т-клетки и другие новости недели

Мышечная дистрофия

1. Ученые из США выяснили, как миотоническая дистрофия I типа (МД 1) связана на молекулярном уровне с когнитивными нарушениями. Миотоническая дистрофия первого типа — это аутосомно-доминантное наследственное заболевание, вызванное увеличением числа повторов CTG в 3'-нетранслируемой области гена миотонической протеинкиназы дистрофии (DMPK). В отличие от других типов мышечной дистрофии, у пациентов с МД1 часто проявляются прогрессирующие симптомы когнитивных нарушений, а также трудности в обучении и социализации, напоминающие расстройства аутистического спектра. Молекулярный механизм, ответственный за эти нарушения при МД 1, ранее был неизвестен. В экспериментах на органоидах коры мозга, полученных из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, ученые показали, что на ранней стадии созревания органоидов наблюдается гиперфосфорилирование белка CELF2. Снижение взаимодействия этого белка с его РНК-субстратом приводит к неправильной регуляции генов, важных для синаптической передачи сигналов в глутаматергических нейронах. В частности, происходит дерегуляция работы MECP2, белка, связывающего метилированную ДНК; как известно, подобные нарушения ведут к когнитивным дефектам. Авторы статьи обнаружили, что антагонисты NMDA-рецепторов позволяют облегчить проявления заболевания в модели органоидов, а значит, в перспективе могут предотвратить когнитивные нарушения у молодых пациентов с миодистрофией и существенно улучшить качество их жизни.

2. В Университете Британской Колумбии (Канада) обнаружили, что лекарство от рака может лечить мышечную дистрофию Дюшенна. Препарат, известный как ингибитор рецептора колониестимулирующего фактора 1 (CSF1R), замедлил прогрессирование мышечной дистрофии Дюшенна у мышей за счет повышения эластичности мышечных волокон. Можно сказать, что открытие было сделано случайно, ведь исследователи изначально планировали изучить роль резидентных макрофагов в регенерации мышц. Во время экспериментов на мышах они обнаружили, что ингибиторы CSF1R, которые вызывают истощение пула резидентных макрофаги, делают мышечные волокна более устойчивыми к повреждениям. Препарат изменяет тип мышечных волокон — с чувствительного к повреждениям типа IIB на устойчивый к повреждениям тип IIA/IIX. Мыши, получавшие ингибиторы CSF1R, оказались более устойчивыми к повреждениям мышечных волокон, лучше выполняли физические упражнения с меньшим вредом для мышц. Ученые планируют проверить, будет ли препарат так же эффективен у людей с диагнозом «миодистрофия Дюшенна».

Иммунология

3. После избавления от инфекции небольшой пул Т-клеток памяти циркулируют по всему телу, а другие накапливаются в нишах органов, чтобы охранять границы организма от патогенов. Авторы статьи в Nature Immunology описали резидентные Т-клетки памяти, находящиеся не в крови, а в тканях почки, селезенки, тонкого кишечника и печени мыши. Данные, полученные из различных типов тканей, позволили понять, какими уникальными процессами управляются популяции Т-клеток в различных органах. Авторы выполнили RNA-seq единичных клеток и проанализировали экспрессию генов и доступность генома мышиных CD8+ T-клеток памяти из органов, реагирующих на вирусную инфекцию, причем выявили как общие, так и тканеспецифические транскрипционные и эпигенетические сигнатуры. T-клетки памяти в кишечнике и слюнных железах экспрессировали гены, индуцированные трансформирующим фактором роста (TGF)-β. Моделирование регуляторных сетей показало, что репрессор транскрипции Hic1 является критическим регулятором дифференцировки Т-клеток памяти в тонком кишечнике. Информация о том, как клетки памяти адаптируются к различным тканевым средам, дает возможность разработать способы усиления защитных реакций в местах, наиболее уязвимых для инфекции.

Онкология

4. В Nature опубликовано исследование, авторы которого показали, что модификации митохондриальной РНК вызывают метастазирование раковой опухоли. Так, развитию метастазов рака головы и шеи способствует модификация m⁵C (5-метилцитозин) в митохондриальной тРНК, несущей метионин. Эта модификация активирует синтез белка в митохондриях, что усиливает выработку компонентов дыхательной цепи. В результате клетка увеличивает продукцию энергии, необходимой ей для выхода из опухоли и метастазирования. За модификацию m⁵C РНК отвечает специфический фермент — метилтрансфераза NSUN3. При его отключении уменьшилось метастатическое инвазивное распространение клеток человеческого рака шеи, подсаженного мыши. Тем не менее отсутствие модификации m⁵C не повлияло на жизнеспособность и рост клеток опухоли. Также оказалось, что митохондриальная генная сигнатура у пациентов с раком головы и шеи позволяет прогнозировать вероятность метастазирования. Наконец, исследователи подтвердили, что ингибирование NSUN3 in vivo препятствует распространению метастазов на доклинической модели. В перспективе данные будут проверены на пациентах с раком головы и шеи.

Эволюция

5. Ученые из Музея естественной истории Университета Колорадо в Боулдере секвенировали гены 16S рибосомной РНК микробиома из образца улитки, 98 лет хранившегося в музее, чтобы определить видовой состав микробиома и сравнить его с микробиомом современных улиток. Выяснилось, что за это время кишечный микробиом улитки Oreohelix strigosa существенно не изменился. Но открытие ученых состоит в другом, ведь они показали, что так можно изучать микробиом животных, образцы которых музеи хранят в этаноле, таких как пауки, лягушки и змеи. А значит, миллионы экспонатов из музеев всего мира могут быть использованы для метагеномных исследований. (Об исследовании собственной ДНК законсервированных экспонатов PCR.NEWS писал на этой неделе.)

6. Жуки семейства усачей (Cerambycidae) распространены по всему миру и известны своей способностью питаться древесиной. Почему ферменты группы GH5_2, позволяющие расщеплять целлюлозу, лигнин и другие компоненты древесин, до сих пор были обнаружены только у жуков-усачей, узнали исследователи из Института химической экологии Макса Планка и Канадской службы леса. Первоначально Cerambycidae приобрели GH5_2 от бактериального донора с помощью горизонтального переноса генов, и эволюция этих ферментов в организме жуков улучшала их способность питаться древесиной. Ученые проанализировали 113 вариантов GH5_2, из 25 видов, охватывающих большинство подсемейств Cerambycidae. Дупликации предковых генов привели к появлению пяти четко определенных групп с явной специфичностью к субстрату, что позволило жукам расщеплять не только целлюлозу, но еще и ксилоглюкан, ксилан и маннаны. Воссоздание предковой формы фермента показало, что он был целлюлазой, способной расщеплять глюкоманнан и ксилан. Авторы предполагают, что успешной радиации жуков-усачей способствовали оба этих процесса — приобретение гена целлюлазы от бактерии и его дупликация и специализация в ходе эволюции.

Нанотехнологии

7. Одна из фундаментальных целей нанотехнологии — программируемый синтез рационально сконструированных кристаллических структур с точным расположением молекул. В частности, центральное ядро для сборки трехмерных решеток можно собирать из разветвленных соединений ДНК. Среди них наиболее известны соединения Холлидея, которые в природе образуются при гомологичной рекомбинации хромосом. Ученые из США и Чехии методом кристаллографии проанализировали влияние на образование кристаллической структуры всех 36 возможных соединения Холлидея из ДНК с разными последовательностями нуклеотидов. Кристаллы удалось вырастить из всех вариантов, кроме шести. Некоторые сочетания нуклеотидов увеличивали разрешение или приводили к уникальной симметрии кристаллов. Моделирование молекулярной динамики несобравшихся кристаллов из шести «фатальных» соединений Холлидея показало, что в них отсутствуют два сайта связывания ионов, ключевых для кристаллизации. Подобные необычные соединения ДНК могут быть использованы в молекулярной инженерии, наноэлектронике и нанофотонике.

Редактирование генома

8. Для Т-клеточной терапии врачи и ученые часто используют сайт-специфические нуклеазы, такие как CRISPR-Cas9, чтобы разрушить ген Т-клеточного рецептора (TCR) или другие гены. Ученые из Израиля провели секвенирование РНК единичных Т-клеток человека после редактирования генома и выяснили, что при этом часто теряются целые хромосомы или их участки. Клетки были трансфицированы генами CRISPR-Cas9 и гидовых РНК, нацеленных на гены TCR и PD1. Через четыре дня после трансфекции в 9% клеток была обнаружена потеря хромосомы 14, несущей локус TCRα. В 9,9% клеток была укорочена хромосома 7, несущая локус TCRβ. Наблюдаемые аберрации подтвердили с помощью флуоресцентной гибридизации in situ и ПЦР. Анеуплоидия была связана с индуцированной активацией p53 и гибелью клеток, поэтому ученые предположили, что со временем такие клетки должны будут элиминироваться из пула. Однако даже через 11 дней после трансфекции в 0,9% Т-клеток все еще отсутствовала хромосома 14. Таким образом, при клиническом применении CRISPR-Cas9. необходимо отслеживать события анеуплоидии и укорочения хромосом.

Фармакология, ВИЧ и синдром Дауна

9. Согласно результатам исследования, проведенного Центром геномной регуляции (CRG) в Барселоне, ламивудин, антиретровирусный препарат для лечения ВИЧ, улучшает когнитивные функции у мышей с синдромом Дауна. Механизм этого феномена заключается в подавлении активности ретротранспозонов — фрагментов ДНК, которые меняют свое положение в геноме, создавая РНК-копии самих себя, внедряющиеся в ДНК в другом месте. При этом они могут случайно встроиться в участки, стимулирующие гены, которые связаны с нейродегенеративными заболеваниями, и усилить их активность. Ретротранспозоны имеют некое сходство с ВИЧ по механизму распространения, кроме того, частота ретротранспозиций увеличивается с возрастом и по мере клеточного старения.

Известно, что у людей с синдромом Дауна повышен риск нейродегенеративных нарушений, так как локус гена APP (белка-предшественника амилоида, вовлеченного во многие подобные заболевания) находится в 21 хромосоме. Авторы исследования предположили, что ингибиторы репликации ВИЧ может также блокировать ретротранспозоны и, как следствие, замедлить процесс нейродегенерации. Эксперименты проводили на мышах линии Ts65Dn, это наиболее изученная на сегодняшний день животная модель синдрома Дауна. В течение четырех месяцев мышей поили водой с добавлением ламивудина, в то время как контрольная группа получала обычную воду. Поведенческие эксперименты, предназначенные для проверки двигательной активности, памяти и уровня стресса, показали, что ламивудин может снизить пагубное влияние синдрома Дауна на когнитивные способности. Исследователи надеются, что эффект также будет проверен на людях.

Метаморфоз

10. Смотреть под водой — совсем не то же самое, что смотреть над водой. Многим организмам приходится приспосабливаться и к той, и к другой среде, а некоторые даже меняют специализацию в ходе жизненного цикла. Группа исследователей из США и Великобритании при помощи секвенирования РНК изучила изменения экспрессии генов в глазах у головастиков леопардовой лягушки и у молодых лягушек, а также проверила методом микроспектрометрии, к красной или синей части светового спектра приспособлены фоторецепторные клетки в глазах амфибии на разных этапах жизни. Удивительно, но 42% генов, задействованных в зрительном восприятии, по-разному экспрессировались в глазах головастиков по сравнению с молодыми взрослыми особями. Микроспектрофотометрия фоторецепторов подтвердила сдвиг в спектральной чувствительности, предсказанный по экспрессии генов. Максимум поглощения фоторецепторов у головастика смещен в красную область по сравнению со взрослой амфибией, что логично: пресная вода содержит растворенные органические вещества и твердые частицы, которые поглощают более коротковолноый свет (фиолетовый и синий). Ученые предполагают, что специализированная экспрессия генов возникла под влиянием противоположно направленного давления отбора на разных стадиях жизненного цикла.

Молекулярная диагностика

11. Быстрые диагностические тесты на малярию, основанные на обнаружении генов HRP2 и HRP3 плазмодиев в каплях крови человека, очень ценны для борьбы с этим заболеванием. Такой тест стоит менее 1 доллара США и проводится примерно за 15 минут практически в любых условиях. Но в районах, где у малярийных плазмодиев наблюдается делеция HRP2 или HRP3, тесты могут давать ложноотрицательные результаты. Коллектив ученых, работавший в различных точках планеты, объявил об успешной разработке нового метода обнаружения генов HRP2 и HRP3. Метод основан на капельной цифровой полимеразной цепной реакции (кцПЦР, ddPCR). Образцы крови разделяют примерно на 15 000 микрокапель и проводят ПЦР одновременно для каждой из них. На одной пластине можно параллельно анализировать 96 образцов. По сравнению с более традиционными методами кцПЦР более чувствительна.

Сначала ученые сравнили эффективность метода ddPCR с обычным методом вложенной ПЦР (nPCR), протестировав 248 образцов крови от людей с бессимптомной формой инфекции в Кении. Результаты вложенной ПЦР ошибочно определили, что у 8% плазмодиев отсутствуют гены HRP2 или HRP3, а метод ddPCR показал, что ни в одном из образцов не было этих делеций. Затем они использовали ddPCR на образцах крови 830 пациентов из Бразилии, Эквадора, Эфиопии, Кении и Занзибара. В Кении и Занзибаре ddPCR не обнаружил делеций генов HRP2 или HRP3. В Эфиопии около 2% образцов имели делецию HRP2 и почти 75% — делецию HRP3. В Бразилии в 62% образцов отсутствовал ген HRP3, а в 46% отсутствовали и HRP2, и HRP3. В Эквадоре ни у одного образца не было делеций HRP2, но около 54% имели делеции HRP3. Таким образом, новый тест позволяет оценить распространенность делеций исследуемых генов в различных точках земного шара и оценить, насколько применимы в той или иной области быстрые диагностические тесты на HRP2 и HRP3.

12. Команда из Японии разработала улучшенный метод РНК-секвенирования. Метод основан на твердофазной амплификации и секвенировании кДНК с помощью терминатора (TAS-Seq) и требует простых реактивов. Для TAS-Seq нужен независимый от состава матрицы фермент, амплифицирующий кДНК, — терминальная трансфераза (TdT). Также для терминации амплификации кДНК используется дидезоксинуклеотидфосфат (ddNTP), что стохастическим образом останавливает чрезмерное удлинение полиN-хвоста TdT и значительно снижает технические трудности реакции. TAS-Seq можно выполнять на привычной платформе для scRNA-seq на основе нанолунок/шариков, которая позволяет изолировать отдельные клетки в образцах тканей.

Исследователи проверили эффективность TAS-Seq и сравнили ее с широко применяемыми методами РНК-секвенирования единичных клеток 10X Chromium V2 и Smart-seq2 на образцах легочной ткани мыши и человека. По их данным, TAS-Seq не только обнаруживает больше генов, но и лучше идентифицирует их вариабельность. Разработка TAS-Seq приведет к новым достижениям в области пространственной транскриптомики, которая также опирается на твердофазный синтез кДНК.

Новости компаний

13. Британская компания по разработке лекарств MultiOmic Health и сингапурский стартап Mesh Bio заявили о сотрудничестве для улучшения диагностики и лечения хронических метаболических заболеваний. В рамках партнерства Mesh Bio будет работать со своей клиентской сетью поставщиков медицинских услуг для привлечения пациентов, а MultiOmic — получать и обрабатывать геномные, протеомные и метаболомные данные из образцов. «Это партнерство дает нам доступ к населению Азии, где наблюдается рост распространенности состояний, связанных с метаболическим синдромом», — заявил Роберт Тонг, соучредитель и генеральный директор MultiOmic. В отличие от большинства исследований этих заболеваний, в которых участвовали пациенты европеоидной расы, новое партнерство позволит получить данные о специфических характеристиках метаболического синдрома у населения Азии.

14. Стартап в области геномики Sequential Skin со штаб-квартирами в Великобритании и Сингапуре получил грант Innovate UK SMART в размере 500 000 долларов США для изучения микробиома здоровой и больной кожи с использованием наборов компании. Компания Sequential Skin ранее выпустила на рынок набор для количественного тестирования микробиома кожи на основе ПЦР, востребованный в индустрии личной гигиены. Новый проект будет посвящен исследованиям атопического дерматита, хронического и рецидивирующего кожного заболевания. Sequential заявила, что будет работать вместе с дерматологами Национальной службы здравоохранения Великобритании, чтобы набирать в исследования пациентов с атопическим дерматитом и тестировать их по мере прогрессирования заболевания в надежде разработать инструменты для диагностики. «Мы видим будущее, в котором пациенты с рецидивирующими и изнурительными кожными заболеваниями получают диагноз с высокой точностью, после чего может быть назначено эффективное и целенаправленное лечение», — заявил генеральный директор и соучредитель Sequential Оливер Уорсли.