Музейная геномика определила систематическую принадлежность редкого вида змеи

Для построения филогенетических деревьев и прослеживания эволюционных связей между организмами необходим генетический материал достаточно высокого качества и в приемлемом для анализа количестве. Порой для заполнения пробелов в деревьях и уточнения связей ученым приходится извлекать ДНК из музейных экспонатов или коллекций. Рыб, рептилий и амфибий обычно сохраняют в фиксирующей жидкости — смеси формалина и спирта. А если образец обрабатывают формалином, ДНК сильно повреждается и может быть непригодна для анализа — генетический материал разрезается на мелкие фрагменты, которые затем могут неправильно сшиваться, также происходит дезаминирование. Авторы нового исследования, результаты которого опубликованы в Frontiers in Ecology and Evolution, предложили новые подходы к выделению и анализа ДНК из образцов, законсервированных десятилетия назад. Они сумели уточнить систематическое положения редкого вида змеи с острова Борнео — Hydrablabes periops.

Этот вид официально принадлежит к многочисленному семейству Natricidae (оно же подсемейство Natricinae — ужовые), которое включает сотни водных видов змей Старого и Нового Света. Но у Джастина Бернстайна из Университете Рутгерса в Ньюарке и его руководительницы Сары Руан возникла гипотеза о принадлежности вида к Homalopsidae — по-английски mud snakes, или грязевые змеи. Гомалопсиды — небольшое семейство преимущественно водных слабоядовитых змей, обитающих в Юго-Восточной Азии.

«Они действительно очаровательны; они живут в мутной водной среде, и их насчитывается 56 видов, — говорит Джастин Бернстайн. — Мы используем ДНК для изучения их эволюционной истории, чтобы попытаться описать новые виды и узнать, что происходило с этими группами на протяжении десятков миллионов лет, что привело к тому разнообразию, которое мы наблюдаем сегодня».

H. periops — редкий вид, получение свежих тканей для анализа сопряжено с трудностями, поэтому ученые приняли решение выделять ДНК из консервированных тканей.

 Hydrablabes periops. Credit: Sara Ruane, Field Museum

Существуют протоколы для экстракции ДНК из подобных образцов. Законсервированные образцы обрабатывают горячими щелочными растворами, протеиназой K и другими ферментами, чтобы лизировать мягкие ткани и разрушить формалиновые сшивки между молекулами. И все же имеющиеся протоколы не позволяют получить высококачественный материал. Кроме того, есть проблемы с биоинформатической обработкой данных.

Для построения филогенетического дерева исследователи секвенировали ДНК из 115 свежих образцов печени и мышц гомалопсид, а также из 41 образца тканей печени, мышц и костей музейных экспонатов, принадлежащих к тому же семейству. Два образца ткани печени получили из герпетологической коллекции Полевого музея естественной истории (Чикаго, США). Также исследователи провели морфологический анализ, сравнив показатели H. periops с литературными данными.

ДНК из консервированных образцов извлекали по модифицированному протоколу Qiagen, с применением набора DNeasy Blood and Tissue. Как отмечает Бернстайн, они увеличили время нагрева и температуру, а также количество протеиназы К по сравнению с тем, что обычно используется. Образцы секвенировали на платформе Illumina NovaSeq 6000. Для анализа данных использовали различные методы и сравнили их эффективность. Необработанные файлы fastq для двух экземпляров H. periops ученые депонировали в библиотеке SRA NCBI. 

Исследователям удалось секвенировать ДНК большинства музейных образцов. Наиболее эффективным оказалось выравнивание на псевдореференс при помощи BLAST. Не было четкой корреляции между выходом ДНК, возрастом образца или полученными необработанными прочтениями. В извлечении последовательностей митохондриальной ДНК удалось добиться результата при использовании MitoFinder, остальные подходы успехом не увенчались.

Независимо от подхода к построению деревьев вид H. periops с той или иной степенью достоверности принадлежал семейству Natricidae, таким образом, гипотеза не подтвердилась. Но Бернстайн говорит, что для него было важно преодолеть предубеждения против молекулярных исследований старых музейных образцов: «Я хотел показать ученым, что с этими образцами все еще можно работать, просто нужно немного повозиться».

Еще о ДНК музейных образцов на PCR.NEWS:

Российские ученые и стеллерова корова

Митохондриальная ДНК птицы моа

Человеческая ДНК из яиц вшей в волосах американских и египетских мумий

Волосы Сидящего Быка

 Джастин Бернстайн в коллекции рептилий Музея Филда. Credit: Sara Ruane, Field Museum