Российский ПЦР-тест выявляет пять возбудителей поверхностных микозов с высокой чувствительностью

erid: LdtCK6FDE

17-18 октября прошел XIII Всероссийский форум Национального альянса дерматовенерологов и косметологов «Дерматовенерология и косметология: синтез науки и практики». На секциях «Микология» и «Подология» Александр Гущин и Ксения Носырева (Московский научно-практический Центр дерматовенерологии и косметологии, отдел аногенитальных дерматозов и инфекций, передаваемых половым путем), представили серию докладов, посвященных развитию методов лабораторной диагностики дерматомикозов в России. Недавно они с соавторами опубликовали в журнале «Клиническая дерматология и венерология» статью, посвященную опыту применения метода ПЦР в реальном времени для диагностики дерматофитий, и теперь поделились со слушателями основными результатами своей работы.

Александр Гущин начал свой доклад с рассмотрения общих вопросов, таких как классификация дерматофитов и локализация вызываемых ими микозов, перечислил основные методы диагностики и подчеркнул, что ПЦР в реальном времени является новым этапом их развития. В этиологии поверхностных микозов 80–90 % занимают дерматофиты, которые более корректно называть дерматомицетами, в то время как остальные 10–20% представлены дрожжевыми грибами рода Candida, а в случае микоза ногтей (онихомикоза) также недерматофитными плесневыми грибами (Non Dermatophytes Molds, NDM). Семейство Дерматофиты (Arthodermataceae) многообразно, оно включает 9 основных родов, наиболее распространенные из них — Trichophyton, Microsporum и Epidermophyton.

По словам Александра Евгеньевича, лабораторная диагностика дерматомикозов значима для подтверждения диагноза при типичной клинической картине, для подбора оптимальной терапии на основе видового определения дерматофитов, дифференциальной диагностики с другими дерматозами и выявления вторичной инфекции у пациентов с неинфекционными заболеваниями кожи. Различные виды грибов имеют разную чувствительность к антимикотическим препаратам, кроме того, необходимо учитывать вероятность побочных эффектов при системной терапии, оценивать риск межлекарственного взаимодействия и возможность назначения детям, беременным и пожилым пациентам.

Среди методов лабораторной диагностики в России ключевыми и наиболее распространенными остаются КОН-микроскопия и микологический посев. В зарубежной литературе часто упоминается PAS-микроскопия (гистологическое исследование с основанием Шиффа). КОН-микроскопия — самый простой и доступный метод, однако с его помощью невозможна видовая идентификация возбудителя. Исторически золотым стандартом является микологический посев, который позволяет идентифицировать вид или хотя бы род, но имеет существенные недостатки: длительные сроки получения результата (2–4 недели для дерматофитов) и чувствительность к сапрофитной микрофлоре, в первую очередь — NDM.

За рубежом в арсенале врачей-дерматологов уже довольно широко представлены коммерческие молекулярно-биологические тесты на основе ПЦР в реальном времени. Их преимущества — высокая чувствительность и специфичность, возможность видовой идентификации, время проведения исследования— 2-3 часа, а также отсутствие субъективности при оценке результата анализа. В России ранее были разработаны ПЦР-тесты с электрофоретической детекцией, но только для выявления двух возбудителей — T. rubrum и T. mentagrophytes, и они были предназначены для диагностики онихомикоза.

Далее докладчик перешел к описанию разработанного им с коллегами первого в России ПЦР-набора «АмплиПрайм Дерматофиты» (ООО «НекстБио»). Он позволяет выявить пять видов дерматофитов: T. rubrum, T. mentagrophytes complex, T. tonsurans, M. canis и E. floccosum. Материалом для исследования служат сухие образцы кожи, волос и ногтей. Взятие образцов аналогично другим методам, хранение и транспортировка проводятся при комнатной температуре в стерильной пробирке с плотно закрытой крышкой. В случае онихомикозов возможно использование цельных фрагментов ногтей, что недопустимо для микологического посева. Метод ПЦР в целом оказался более чувствителен, чем посев и микроскопия, независимо от типа биоматериала, который использован для исследования.

Результаты сравнения трех лабораторных методов выявления дерматофитов — КОН-микроскопии, микологического посева и ПЦР-тестирования — в своем докладе представила Ксения Носырева. Она напомнила слушателям, что дерматофиты рассматриваются как облигатно-патогенные (то есть отсутствующие в составе нормальной мико- и микробиоты кожи) микроорганизмы, и их выявление требует обязательного лечения, которое довольно длительно и занимает от нескольких недель до нескольких месяцев, а иногда требует карантинизации инфицированных. Источником возбудителя инфекции являются инфицированные люди, часто члены семьи, или инфицированные животные. Предрасполагающие к развитию инфекции факторы — прием лекарственных препаратов, угнетающих иммунитет, системные заболевания, частое посещение бассейнов, саун, спортзалов, использование моющих средств, размягчающих кожный покров, и др.

Целью исследования, проведенного Ксенией Константиновной и ее коллегами, была оценка эффективности ПЦР в реальном времени относительно классических методов диагностики поверхностных микозов. В выборку для исследования вошли 258 образцов, при этом положительный результат всеми методами был получен только в 20 случаях. Еще 12 образцов были положительны по ПЦР и микологическому посеву. Для двух образцов положительный результат был зафиксирован с помощью ПЦР и КОН-микроскопии. Для 54 образцов положительный результат был показан только методом ПЦР, в то время как классические методы не выявили патогенов. Положительные по ПЦР образцы специалисты проверяли с помощью секвенирования по Сэнгеру, чтобы подтвердить наличие ДНК дерматофитов соответствующих видов.

Далее Ксения Константиновна перешла к сравнению чувствительности ПЦР-набора при работе с тремя видами биоматериала. Самую многочисленную выборку составили образцы кожи. Из 154 образцов положительными по ПЦР были 34 %, тогда как посев и микроскопия смогли выявить только 15% и 11% случаев соответственно. Чаще всего выявлялся M. canis, вторым по распространенности был T. tonsurans. При этом чувствительность классических методов в сравнении с ПЦР оказалась очень низкой.

Похожая картина была продемонстрирована для образцов волос, однако для T. tonsurans в 83 % случаев результаты микологического посева были ложноотрицательными, так как высеваемость данного вида оказалась в 4,6 раз ниже, чем у M. canis. Это может быть связано с типом поражения волос. Для M. canis характерен тип Ectotrix — гриб находится снаружи волоса и свободно попадает в культуральную среду, тогда как T. tonsurans имеет тип Endotrix, и значительная его часть оказывается «заперта» внутри волоса.

В случае образцов ногтей наиболее чувствительным методом тоже оказался ПЦР в реальном времени. Наиболее часто выявляемыми видами были T. rubrum и T. mentagrophytes complex. Результаты обнаружения этих видов с помощью посева в 94% и 100% случаев соответственно были ложноотрицательными.

В заключение докладчица привела примеры применения всех трех методов диагностики в клинике. У одного из пациентов предполагалась болезнь Девержи, в течение года проводилось лечение кортикостероидами, что привело к ухудшению клинической картины. Микробиологические методы дали отрицательные результаты. С помощью ПЦР была обнаружена ДНК T. tonsurans.

В своем втором докладе Александр Гущин более подробно раскрыл тему специфической диагностики онихомикозов (грибковых поражений ногтей). Он обратил внимание слушателей на то, что дерматофиты — истинные этиологические агенты онихомикоза, так как имеют механизмы активной инвазии за счет ферментов кератиназ, проникают на всю толщину ногтевой пластины и формируют сеть между корнеоцитами и внутри них. В этом случае необходима системная терапия, длительные курсы лечения, и следует обращать внимание на совместимость с другими препаратами и возможные побочные эффекты. В то же время контаминантами кожных покровов могут быть дрожжевые грибы (Candida spp.) и недерматофитные плесени (NDM). В этом случае возможна местная терапия.

Среди классических методов диагностики онихомикозов, применяемых за рубежом, наибольшую чувствительность (84%) имеет гистологическое исследование (PAS-микроскопия), в то время как самая низкая чувствительность показана для микологического посева (56 %). При этом в России в проектах клинических рекомендаций сказано только о культуральном исследовании чешуек при микозе.

Александр Евгеньевич подчеркнул, что по результатам проведенной ими работы чувствительность нового ПЦР-теста для диагностики дерматофитий при исследовании образцов ногтей была в четыре раза выше, чем у КОН-микроскопии, и в 24 раза выше, чем у микологического посева. В этом случае большое значение имеет локализация очага поражения ногтя и способ получения и обработки материала. Докладчик объяснил, что результат посева из образцов ногтей может быть отрицательным даже при высоких концентрациях ДНК T. rubrum и T. mentagrophytes complex. Это может быть связано с тем, что грибок «заперт» в ткани ногтя и не дает роста при попадании фрагментов ногтей на поверхность агара. Также следует учитывать, что поверхность ногтя может быть контаминирована в первую очередь NDM, у которых скорость роста значительно выше, чем у дерматофитов, и это может привести к ошибкам в установлении этиологии онихомикоза по результатам микологического посева.

В заключение Александр Евгеньевич также привел примеры использования ПЦР-диагностики онихомикозов в клинической практике. В одном случае результаты всех трех использованных методов совпали. В другом примере КОН-микроскопия показала наличие мицелия грибов у пациента, по результатам посева выявлен рост культуры Aspergillus spp. Однако, клиническая картина была характерна именно для дерматофитии, и ПЦР-анализ показал наличие ДНК T. rubrum, благодаря чему был выбран другой подход к лечению.

Таким образом, разработанный российскими специалистами набор реагентов на основе ПЦР в реальном времени «АмплиПрайм Дерматофиты» обладает самой высокой чувствительностью и специфичностью в сравнении с классическими методами диагностики поверхностных микозов, что в перспективе позволяет рассматривать метод ПЦР в качестве метода выбора.

Реклама. Рекламодатель ООО «ИЛС»