Технологии будущего — задача, решаемая уже сейчас

Запись прямой трансляции лекций доступна на YouTube, а мастер-классы можно посмотреть, оставив заявку на сайте.

Сергей Киселев, д.б.н., заведующий лабораторией эпигенетики в ИОГен, открыл конференцию докладом о развитии генной и клеточной терапии в России и мире. Он рассказал об одобренных в Европе и США препаратах для генной терапии, а также о регистрации в России отечественного генно-инженерного препарата Неоваскулген в 2017 году.

Инновационные технологии проходят закономерный путь развития от изобретения до повсеместного использования: сначала они проходят посевную фазу, затем фазу выращивания, и наконец, фазу внедрения. Нахождение технологии на определенном этапе ее развития называют индексом зрелости технологии. По словам Сергея Львовича, генная терапия сейчас проходит тот же путь, что когда-то проходили терапевтические антитела. Когда умер первый пациент, получивший генную терапию, снизилось количество патентов и проводимых клинических исследований, но ученые продолжали публиковать работы, так как верили в технологию.

Во время пандемии SARS-CoV-2 случились ранее немыслимые события: без многолетних проверок на мировой рынок поступили шесть вакцин, содержащих ген, который экспрессируется в организме. До пандемии эксперты предсказывали, что фаза выращивания для генно-инженерных лекарств продлится как минимум до 2035 года, а сейчас рамки сдвинулись до 2025 года. Докладчик подвел итог, сказав, что технология генной терапии в ускоренном темпе прошла посевную фазу и уже перешла в фазу выращивания.

Вадим Говорун, д.б.н., академик РАН, директор НИИ дезинфектологии, прочитал лекцию «О синтетической биологии». Доклад он начал с вопроса «Что такое минимальная жизнь?», обращенного к исследователям организмов с минимальным геномом, например, микоплазм. Вадим Маркович охарактеризовал системную биологию как науку, приступившую к синтезу омиксных данных о клетке и об организме. Важную роль в этом играют фазовые переходы в конденсированных средах, которые почти невозможно изучать in vitro. Докладчик также рассказал о подходах к созданию искусственной жизни: об уменьшении генома существующих организмов и о сборке геномов de novo. Синтетическая биология — это, как считает Вадим Маркович, в первую очередь практика.

Петр Тимашев, д.х.н., директор НТПБ Сеченовского университета, рассказал о технологиях биопринтинга. Биопечать — это метод послойного точного позициронирования биоматериалов, биологически активных веществ и живых клеток для создания трехмерных структур. Для биопечати нужен биопринтер и биочернила. Сырьем для биопечати могут быть как первичные клеточные культуры, так и клеточные линии. Петр Сергеевич рассказал о различных способах биопечати. Первые 3D-структуры были напечатаны по принципу работы обычного струйного принтера. Самая современная технология — LIFT bioprinting. В ней используются золотые пластинки, над ними помещен гидрогель, а под ними — донорные клетки. Лазер выстреливает, из пластинки вылетают наночастицы золота, несущие донорные клетки и гидрогель. Технология 4D-биопринтинга использует воздействие стимулами на напечатанную систему для придания нужной формы. Докладчик предположил, что в будущем появится новая медицинская специальность — регенология. Врач-регенолог сможет самостоятельно использовать системы для биопечати в клинической медицине.

Алексей Пазилин из компании Thermo Fisher Scientific (далее TFS) представил участникам новое решение для генетического анализа: QuantStudio Absolute Q Digital PCR System. Система основана на принципе цифровой ПЦР, в которой приготовление образцов происходит аналогично количественной ПЦР, но точность выше благодаря микрофлюидным технологиям. Между автоматической загрузкой образцов и получением результатов проходит всего 90 минут, и при этом инструмент моноблочный, поэтому ему требуется минимальная сервисная поддержка. Стандартный чип содержит 20480 дискретных микрореакторов, объем реакционной смеси составляет 9 мкл, и на один чип загружается до 16 образцов. Партнерам поставляется прибор, компьютер, программное обеспечение и набор для начала работы: МАР16 планшет, крышки для стрипов, изоляционный буфер, мастер микс и верификационный набор.

Елизавета Губина из отдела генетического анализа компании TFS рассказала о ДНК-микрочипе для выявления однонуклеотидных полиморфизмов (SNP), инсерций, делеций или вариаций числа копий генов (CNV). На чипе GeneTitan можно разместить от 160 тысяч до 6,5 миллионов биомаркеров, а по задачам партнера компания разрабатывает кастомные и готовые решения любого уровня сложности, производит чипы и жидкие части системы, а также осуществляет биоинформатическую поддержку клиентов. Продукция используется для многочисленных крупных проектов, таких как UK Biobank.

Согласно независимому исследованию, в 2023 году рынок генетических чипов достигнет 5,52 млрд долларов.

Елена Савчик - представитель компании «Аламед» сделала доклад о новинках NGS-технологий. Главной проблемой NGS сейчас является нехватка специалистов. Внедрению технологий препятствуют сложность, дороговизна и медленность пробоподготовки: полное время цикла — от 4 до 7 дней. Cеквенатор Ion Torrent Genexus в паре с  Genexus Purification System сильно облегчает рабочий процесс: при использовании такой системы от пробоподготовки до интерпретации данных проходит до суток. IonTorrent GX5 Chip позволяет получить от 12 до 15 миллионов прочтений на каждой из четырех линий. Наборы Oncomine для онкодиагностики по минимуму задействуют ручной труд: работа занимает всего 15 минут. Приборы линейки Genexus применяются в том числе для таргетного секвенирования геномов SARS-CoV-2, так как программное обеспечение сразу определяет штаммы и строит филогенетические деревья. Станции выделения нуклеиновых кислот на магнитных частицах Genexus Purification System позволяют уменьшить время пробоподготовки до 1,5-4,5 часов. Если лаборатория не сталкивалась с NGS до покупки прибора, то при наладке метода не возникнет трудностей, так как для этого не требуется специально обученный человек.

Антон Витовтов из TFS рассказал, как повысить эффективность исследований в области клеточной терапии. Чтобы превратить стволовые или иммунные клетки в лекарство, их получают от донора или самого пациента, модифицируют определенным образом, затем снова вводят пациенту. На каждой из этих стадий нужны строгие контроли и налаженный процесс очистки материала. Система центробежного противотока Gibco CTS Rotea разработана специально для клеточной терапии. Она позволяет совместить процессы центрифугирования и концентрации клеток. Bigfoot Cell Sorter — это высокоскоростной спектральный клеточный сортер. Кластеризация событий, детектируемых с помощью этого сортера, основана на методах машинного обучения. Для визуализации клеток компания разработала инвертированный микроскоп EVOS 5000 Imaging System и клеточный счетчик Countess 3FL. Работа проточных цитофлуориметров Attune NxT и Attune CytPix основана на акустической технологии: когда включается пьезоэлектрический элемент, клетки выстраиваются в ряд за счет акустической фокусировки. Это создает узкий поток клеток для одинакового освещения их лазером вне зависимости от скорости анализа. Благодаря увеличенному диаметру капилляра прибор детектирует и клеточные взаимодействия: например, иммунные синапсы в случае CAR-T. Для оценки жизнеспособности Т-клеток перед инфузией спикер рекомендует использовать красители SYTOX Red Dead и CalceinAM.

Исследование клеток — ключ к клеточной и генной терапии

Открывает серию мастер-классов тема оборудования и расходных материалов для выделения и культивирования клеточных культур, трансфекции и других методик клеточной биологии. Участники узнали о преимуществах нового культурального пластика и клеточных сред, а также проделали путь получения клеточной линии, сконструированной для специальных задач.

Проводилась демонстрация работы на клеточном счетчике Countess 3FL, на электропораторе для клеток млекопитающих Neon Transfection System и на современном инвертированном микроскопе EVOS 5000 Imaging System.

Исследование белков от А до Я

Как превратить рутинные исследования белков методом вестерн-блоттинга в быстрый и стандартизированный процесс?

Автоматическое выделение белков на магнитных частицах можно проводить с помощью системы KingFisher Apex. Процесс вестерн-блоттинга начинается с заливания полиакриламидного геля. На гель нанесли образцы белков, маркер-лестницу и маркер прохождения электропереноса. Электрофорез поставили 200 мВ на 22 минуты. Максимально сократить процесс электрофореза позволило использование буфера Novex Bolt.

За электрофорезом следует стадия электропереноса проб на мембрану. Крупные белки ведущие мастер-класса рекомендуют переносить мокрым способом, средние белки — с помощью устройства Power Blotter, которое переносит белки полусухим способом за несколько минут. Небольшие белки быстро переносятся с помощью камеры iBlot для сухого переноса. На мастер-классе показали, как помещать гель и мембрану в Power Blotter, и установили время переноса: процесс занял 7 минут.

Далее гибридизация с антителами производилась с помощью iBand: устройства, работающего без электричества по принципу хроматографии. В отверстия на приборе наносятся первичные антитела, вторичные антитела и буфер для отмывки. На один гель можно поместить до 6 разных антител. Растворы перемещаются по мембране последовательно: сначала по току жидкости идут первичные антитела, потом отмывка, затем вторичные и снова отмывка. Из-за того, что антитела идут фронтом, их не нужно разводить в большом объеме. Процесс окраски суммарно занимает 2,5 часа, поэтому во время мастер-класса посетителям для наглядности демонстрировали результат «окраски» ворсистой бумаги iBand Card пищевыми красителями.

 iBand Card, окрашенная пищевыми красителями

Для визуализации результатов вестерн-блоттинга ведущие порекомендовали iBright. Прибор визуализирует гели, окрашенные хемилюминесцентным или флуоресцентным красителем. Главное преимущество iBright — высокое качество изображения, что достигается благодаря 9.1-мегапиксельной камере. У прибора есть механический поворотный столик: если гель был положен неровно, то больше не нужно обрабатывать бэнды в графическом редакторе и понижать качество изображения. У iBright есть автофокус и автоматический подбор параметров выдержки. Участникам предложили порисовать флуоресцентными красками и визуализировать на экране результат.

Микрочипы Axiom для высокопроизводительного генотипирования и ХМА

ДНК-микрочип  Axiom — это  новый, мощный инструмент для идентификации полиморфизмов геномов растений и животных. В основе технологии лежит фотолитография — печать светом на твердых носителях. На каждом планшете содержится большое количество чипов, на которых иммобилизованы олигонуклеотиды. Такие микрочипы дают 100%-ную воспроизводимость: все маркеры присутствуют на чипах всегда!

Готовые данные отображает специальная  программа Chromosome Analysis Suite , представляющая собой табличку с описаниями проб, метрикам качества и сообщениями о том, прошли ли образцы контроли качества. А благодаря виртуальному туру по лаборатории Thermo Fisher Scientific в Дармштадте были показаны  нюансы работы с микрочипами.

Высокоскоростная проточная цитометрия

Посетители этого мастер-класса своими глазами увидели преимущества технологии акустической фокусировки. Антон Витовтов рассказал об эксплуатации этого прибора и за считанные секунды продемонстрировал на Attune NxT, как эритроциты отделяются от других клеток в образце цельной крови. Скорость анализа может быть задана в диапазоне от 12,5 до 1000 мкл/мин, и при этом частота детекции событий будет составлять до 35 000 событий в секунду. Пробы даже больших объемов прибор прогоняет за несколько минут, а акустическая фокусировка обеспечивает очень низкий расход используемых растворов. Всего для работы используется четыре типа жидкостей, только две из которых нужны для каждого запуска. Третья используется для промывок между экспериментами, а четвертая — для перехода в спящий режим.

Пока прибор пропускал через капилляры клетки крови, на экране компьютера стало видно, как идет расход образца и как детектируются события. Программа позволяет выставить настройки так, чтобы прибор собрал определенное число лимфоцитов и остановился. Если часть образца осталась неотсортированной, она возвращается в пробирку.

Важный этап экспериментов с клетками крови — составление панели используемых антител для мечения различных типов клеток. Для этого спикер рекомендовал использовать онлайн-платформу Panel Builder Thermo Fisher Scientific. Пользователь программы выбирает антитела и флуоресцентные белки, которые собирается использовать, а также изучаемый организм и тип клеток. Программа позволяет ввести количество исследуемого антигена — малое, среднее или большое; от этого будет зависеть способ подсчета вероятности ошибки. В панель также можно добавить красители на жизнеспособность для живых и неживых клеток. Линейка флуоресцентных меток NovaFluor отличается узкими пиками эмиссии, что позволяет использовать большее количество флуорофоров в исследовании. С помощью программы SpectraViewer пользователь оценивает перекрывание спектров возбуждения и испускания флуоресцентных молекул.

При выборе моноклональных антител важно подобрать не только нужный флуорофор, но и правильный клон. Сотрудник компании рекомендовал покупать один и тот же клон, если для данного антитела протоколы в лаборатории уже отработаны. А при покупке новых антител советовали смотреть, у какого клона больше цитирований. Упоминать в публикациях антитела полезно самим авторам, так как ссылка на статью появится на сайте производителя, и повысится вероятность ее цитирования, отметили организаторы.

Тем временем к цельной крови добавили антитела к CD45+, и образец из цилиндрической пробирки поместили в лунки плашки. Attune NxT совместим не только со стандартными пробирками для цитометрии, но и с 96- и 384-луночными планшетами. 96-луночные планшеты могут иметь объем до 2 мл, что полезно при исследовании редких популяций лимфоцитов. Для удобства работы с большим потоком образцов, клетки в которых слипаются со временем, в прибор встроен авторазмешиватель.

Уже через 5 минут после запуска цитофлуориметр проанализировал загруженные в него пробы, и на экране высветились графики, на которых была отчетливо видна кластеризация субпопуляции CD45+ лимфоцитов, помеченных антителами.

Также в рамках конференции проходили мастер-классы,   демонстрирующие  недавно анонсированную производителем полногеномную экосистему Genexus, которая отличается простотой и удобством в использовании, и SeqStudio — систему для секвенирования по Сенгеру и фрагментного анализа.

Это и многое другое было представлено на научно-практической конференции «Life Science: технологии, которые меняют жизнь»

Отрасль в целом и компании в частности активно движутся вперед, внедряя новые технологии, активно работая над демонстрацией оборудования в виртуальной реальности. Уже сейчас есть инструмент, позволяющий «создавать» лабораторию в виртуальной реальности под свои потребности и это не предел возможностей. Но способны ли цифровые технологии заменить возможность личного общения и живого обсуждения животрепещущих научных вопросов?

Организаторы выражают благодарность спикерам, участникам, гостям и партнерам проекта и ждут вас в 2022 году!

Партнерский материал