QuantStudio Absolute Q Digital PCR System: все преимущества цифровой ПЦР и простота количественной ПЦР

На первый взгляд количественная и цифровая ПЦР очень похожи — они обе определяют исходную концентрацию таргетной ДНК в образце. И там, и там для детекции используется флуоресценция, а для получения результатов — специальный софт. Но при количественной ПЦР флуоресценция измеряется в определенные моменты времени, а исходную концентрацию таргета экстраполируют с помощью стандартной кривой. Такой подход можно назвать «аналоговым». В его основе лежит целый ряд допущений — что реакция шла по экспоненте, что плато не было достигнуто, что исходная концентрация не была слишком низкой и т.д.

Цифровая ПЦР обходит целый ряд ограничений количественной ПЦР. Здесь стандартная кривая не нужна. Реакционная смесь распределяется по тысячам маленьких независимых микрореакторов. Каждый такой микрореактор содержит одну копию таргетной ДНК или не содержит ни одной. Реакция может пройти или не пройти, то есть здесь действует бинарная логика цифрового мира. Подсчитав число микрореакторов, где реакция прошла, мы сразу получаем исходную концентрацию таргетной ДНК, без приближений. Статистическая обработка позволяет учесть такие ошибки, как, например, попадание нескольких молекул в один микрореактор.

Как и во многих современных технологиях, на первое место выходит человеческий фактор. Постановке цифровой ПЦР нужно учиться специально, и цена ошибки бывает очень высока — результат может отличаться от истинного в разы. Однако компания Thermo Fisher Scientific держит руку на пульсе. Их новый прибор — QuantStudio™ Absolute Q™ Digital PCR System — сочетает в себе все преимущества цифровой ПЦР с простотой количественной. Все необходимые этапы — распределение по микрореакторам, циклы нагрева и охлаждения, сборка данных — выполняются в одном приборе.

Пробоподготовка занимает пять минут. После этого реакционная смесь наносится на чип, а потом дело за прибором. Результаты можно получить уже через 90 минут.

На каждый микрофлюидный чип Microfluidic Array Plate (MAP) можно нанести до 16 образцов. Если вам столько не нужно — не проблема. Незаполненные лунки можно использовать позже. По тонким каналам реакционная смесь от лунки распределяется по 20 480 микрореакторам.

Твердые микрореакторы обладают определенным преимуществом по сравнению, например, с эмульсионными технологиями — воспроизводимостью. Вариативность заполнения реакционных зон — менее 1%.

Система детекции содержит четыре оптических канала и позволяет анализировать 95% образца за одну реакцию (у других аналогичных платформ — 25–60%). То есть менее 5% реагентов тратится впустую. Также повышаются чувствительность и точность измерений.

 Четыре таргета в одной реакции: Target 1 (FAM), Target 2 (VIC), Target 3 (ABY) и Target 4 (CY5)

Система защищает пользователя от ошибок несколькими способами. Так, уровень флуоресценции референтного красителя должен попадать в допустимый диапазон значений. Ложноположительные результаты, полученные из-за попавшего в смесь мусора, не учитываются в конечном анализе. «Шум» также отсекается. В конце концов анализируются только те микрореакторы, которые демонстрируют нормальное «поведение».

Для новой системы разработан QuantStudio Absolute Q DNA Digital PCR Master Mix. Вся реагентика основана на проверенной химии TaqMan, которая используется в ПЦР в реальном времени. С ее помощью уже провели более 200 тысяч исследований.

Специально разработанные флуоресцентные зонды короче обычных, но благодаря особой химической группе имеют более высокую температуру плавления. У компании Thermo Fisher Scientific есть готовые решения для исследований в области онкологии и жидкостной биопсии, для точного подсчета вирусных геннотерапевтических векторов и для других целей. Но если готового решения нет, праймеры и зонды можно без проблем сделать на заказ.

Каковы области применения QuantStudio Absolute Q Digital PCR System? Их множество: онкология, репродуктология, диагностика инфекционных и наследственных заболеваний, редактирование генов. Этот подход незаменим для измерения количества редко встречающихся таргетов, генотипирования, обнаружения вариаций числа копий и измерения генной экспрессии.

Софт поставляется с прибором, его легко установить и легко пользоваться. Если возникнут проблемы — всегда на связи служба поддержки.

Партнерский материал