«На рыбе сразу видно, где ты допустил ошибку»
Маленькие, неприхотливые, выносливые. Ради науки могут быть прозрачными или светиться, могут оставаться неподвижными и дышать в чужой для себя среде или показать, с чего начинается заживление раны… О жизни маленькой лабораторной рыбки рассказала PCR.NEWS Анастасия Сергеева, сотрудница отдела метаболизма и редокс-биологии ИБХ РАН.
— Эти аквариумы мы делаем в лаборатории сами, — поясняет Анастасия Сергеева, входя в комнату, где содержатся рыбы. — Первые, конечно, покупали, но потом среди нас нашелся умелец, который сам клеит их из оргстекла. Почти не отличаются от коммерческих.
Помещение занимают две стойки почти до потолка, в каждой — ряды тех самых аквариумов-отсеков с модельными рыбками. Все маркировано наклейками: линия, поколение, экспрессия того или иного трансгена.
Павел Русанов
— Трансгенных рыб мы здесь получаем, трансдуцируя икринки на стадии одноклеточного эмбриона, — рассказывает Анастасия. — В среднем каждая десятая рыбка нулевого поколения будет нести целевой ген. Выращенное из такой икры потомство скрещивают с диким типом и отбирают уже среди их потомков тех, кому ген передался, — это делается по репортерному флуоресцентному белку. Конечно, при таком методе в каждого нового потомка будет встроено разное количество копий нужного гена, поэтому уровень экспрессии может сильно варьировать. Самые ценные для нас линии мы разделяем, чтобы вывести из них уже линию со стабильной и равномерной экспрессией трансгена.
Данио-рерио — удобный в работе и неприхотливый объект исследований. Войдя в науку как модель для изучения эмбриогенеза около восьмидесяти лет назад, эти рыбки стали теперь весьма распространенными лабораторными животными с подробно изученным геномом.
Первым ими активно заинтересовался Джордж Стрейзингер — этот молекулярный биолог получил клоны рыбок и тем самым сделал данио первым клонированным позвоночным. Сейчас для получения генетически идентичного потомства применяют гиногенез — эту форму партеногенетического размножения индуцируют с помощью теплового шока.
Особенности иммунной системы, а именно отсутствие адаптивного иммунитета, делают мальков данио-рерио удобным объектом для ксенотрансплантации. Подсаженные рыбке образцы опухолей не будут отторгаться иммунной системой, следовательно, на них можно тестировать лекарства и проводить разнообразные исследования in vivo.
Их используют в различных физиологических исследованиях (в частности, регенерации), для моделирования наследственных заболеваний и много где еще.
— С рыбами во многом работать удобнее, чем с теми же грызунами, — признает Анастасия, — хотя на крысах у нас проводится довольно много экспериментов. Но на рыбе сразу видно, если ты допустил ошибку, и гораздо меньше нужно ждать результатов из-за быстрого размножения и развития.
Как остановить каспера
Часть аквариумов населена «касперами» — практически прозрачными рыбками. Эта линия — двойной мутант, лишенный одновременно меланофоров (пигментных клеток, в норме имеющихся у рыб) и иридофоров (светоотражающих клеток).
— Трансгенов раньше старались получать именно на них, но, к сожалению, они оказались довольно слабыми. Из-за низкой жизнеспособности пришлось смешивать касперов с диким типом, переводя их в гетерозиготу. Но от такой практики вскоре отказались — если уж работаем с линией AB, то пусть она и будет основной для наших моделей.
Credit:
Павел Русанов
Пусть и не лишенные окраски, мальки линии AB также хорошо подходят для прижизненной визуализации — малые размеры тела рыбки играют на руку исследователю. Необходимо деликатно зафиксировать исследуемый объект и обеспечить ему полноценное дыхание, пока он лежит под объективом микроскопа или бинокуляра.
— Для этой цели можно использовать довольно забавную систему, если речь идет о взрослых рыбах. Берется губка, в которой делается небольшая прорезь, рыбку кладут туда. В рот рыбке вставляют специальную трубку, по которой подается насыщенная кислородом вода. В такой конструкции жабры омываются, но сама рыбка обездвижена, — объясняет Анастасия. — Но, как я уже сказала, это подходит для взрослых рыб, в нашем случае это пока только в планах — частью одной из дальнейших работ станет прижизненная визуализация мозга бесцветных рыбок.
Мальков же для проведения прижизненной съемки анестезируют и обездвиживают, помещая их в 1%-ную агарозу. Бывает, кстати, специальная агароза для визуализации — производитель заявляет, что она более прозрачная.
Дыхание рыб
Данио-рерио появились в этой лаборатории как модельный объект около семи лет назад: «Это был долгий путь, и рыба только недавно встала на ноги», — шутит Анастасия. Активно использовать рыбок в качестве модельного объекта начали лишь в последние два-три года. Большую часть времени они были дополнительными объектами в тех или иных экспериментах, и лишь недавно вышла статья, сделанная целиком на данио. Анастасия, как первый автор, рассказывает об этом исследовании подробнее:
— Рыбок использовали для моделирования гипоксии. В ходе эксперимента они лежали в проточной установке — специальной камере, которую можно установить прямо на микроскопный столик. На вход подается ток азота, чтобы вытеснить кислород, а параллельно с этим вытесняется кислород из воды. По специальным трубкам в камеру закачивается деоксигенированный раствор, в котором и будут находиться подопытные данио. В целом мы эту установку много где применяем, но адаптировали в том числе и для экспериментов с рыбами.
Сперва в рамках работы исследователи подтвердили развитие ацидоза при гипоксии в тканях — закисление оценивали при помощи генетически кодируемого флуоресцентного сенсора pH — SypHer3, созданного в этой лаборатории ранее.
— А дальше мы смотрели генерацию пероксида водорода в разных тканях (для этого использовался другой флуоресцентный сенсор, HyPer7. — PCR.NEWS), причем как в цитоплазме клеток, так и в митохондриях. Сравнивали в первую очередь скелетную мускулатуру, сердечную мышцу и мозг. И мы заметили, что пероксид генерируется в митохондриях и накапливается в их матриксе, причем во время гипоксии его уровень растет. Это немного не сходится с типичными представлениями о влиянии гипоксии на организм. В цитоплазме, кстати, генерации пероксида не наблюдается, так что митохондрии остаются его единственным клеточным источником при общем недостатке кислорода.
Для изучения гипоксии данио-рерио — весьма практичный объект. Двухдневные мальки, например, крайне устойчивы к недостатку кислорода и могут относительно спокойно находиться в аноксических условиях в течение часа или даже двух.
— Это связано, в частности, с тем, что в таком возрасте у них сохраняется эмбриональный гемоглобин, который гораздо прочнее связывает кислород, чем гемоглобин взрослого организма. На самом деле даже при низкой концентрации кислорода в окружающей среде их гемоглобин все еще связан с кислородом. Совсем юные мальки, кстати, вообще хорошо приспособлены к переживанию неблагоприятных факторов. Однодневная рыбка может даже «заморозить» свой метаболизм на какое-то время и просто полежать, дожидаясь более приемлемых условий среды.
Анастасия отлавливает пару пятидневных трансгенных мальков, экспрессирующих в тканях флуоресцентный SypHer3. Мальки выводятся из икринок в «рыбьих яслях» и первое время обитают отдельно — подсаживать их к взрослым рыбам чревато, в частности, тем, что слишком мелкий малек может покинуть пределы аквариума по системе подачи воды и тем самым испортить результаты выведения какой-нибудь экспериментальной линии. Если, конечно, взрослые рыбы не съедят его раньше — такой риск тоже существует.
Павел Русанов
— Эту стойку тоже собрал наш умелец. Она совсем простая: трубки, отвод, капельная подача и корытца с рыбами, купленные на условном вайлдберриз. Рядом емкости, в которых мы разводим парамеций на корм малькам. Сначала мальки питаются исключительно за счет желточного мешка, но на пятый день у них открывается рот. Правда, употреблять они могут только маленькую пищу, поэтому сначала их кормят инфузориями. Рачков артемий — корм для взрослых рыб — им начинают давать, когда они подрастают, обычно к десятому дню жизни.
Для визуализации рыбок анестезируют трикаином — типичный анестетик для рыб. «Заснувших» мальков помещают в остывшую расплавленную агарозу. Удобство в том, что после наблюдения их можно оттуда освободить, и если не было проведено каких-то калечащих манипуляций, этих рыбок можно сохранить для дальнейших экспериментов.


Воспаление под микроскопом
— Еще мы моделируем на рыбах рану хвостового плавника, — рассказывает Анастасия. — Это вообще, мне кажется, самая распространенная воспалительная модель на рыбе. Скальпелем отрезается кусочек хвостика, и эта травма приводит к местному воспалению. Конкретно мы в такой модели смотрим миграцию нейтрофилов к месту повреждения.
И здесь речь заходит о еще одном биосенсоре, сконструированном в этой лаборатории. Важную, хотя и не слишком пока охарактеризованную роль в различных патологиях, включая воспаление, играют гипогалогенные кислоты (HOCl или HOBr). В частности, гипохлорит продуцируется активированными нейтрофилами. Оценивают их активацию и миграцию в данном случае с помощью высокочувствительного сенсора на гипогалогенные кислоты, получившего название Hypocrates. Созвучие с именем «отца медицины» Гиппократа неслучайно — именно этот знаменитый древнегреческий врач одним из первых описал признаки воспаления и задумался о природе этого процесса.
Хвост повреждали у трансгенных мальков, экспрессирующих Hypocrates и HyPer одновременно. В аналогичном эксперименте ученые уже показали, что в области раны значительно возрастает концентрация H2O2 — она достигает максимума примерно через 20 минут после ампутации части плавника. Однако, как уже говорилось, в воспалении участвуют еще и гипогалогениты — именно их динамику сопоставляли с изменениями уровней пероксида. В первые 15 минут в области повреждения накапливались оба типа соединений, однако затем сигнал HyPer снижался. Это объясняется тем, что нейтрофилы, привлекаемые к воспаленному участку, разлагают H2O2 с помощью миелопероксидазы и производят гипогалогеновые кислоты.
Маленькая прозрачная рыбка, таким образом, позволила ученым наглядно показать, как разработанные ими биосенсоры можно комбинировать, чтобы наблюдать динамику реакционноспособных соединений в клетках и выяснять тонкости их взаимодействий.
Павел Русанов
Credit:
Павел Русанов
О других модельных животных на PCR.NEWS: