Воскресное чтение. Обзор научной периодики за 18–24 октября

Генная терапия

1. Ученые из США разработали платформу scAAVengr для оценки эффективности разных серотипов аденоассоциированных вирусов для генной терапии. В этом методе библиотеку из нескольких вариантов AAV, каждый из которых несет последовательность GFP с уникальным баркодом, вводят в ткани модельного животного, например, в сетчатку. Спустя несколько недель ткани разделяют до единичных клеток и получают библиотеки кДНК, соответствующие профилю экспрессии в каждой клетке. По таким библиотекам можно узнать одновременно тип клетки и уровень экспрессии гена, внесенного AAV. Таким образом выясняют тканеспецифичность каждого из AAV исходной библиотеки и выбирают для терапии наиболее эффективный вектор. Процесс занимает всего несколько месяцев и позволяет тестировать сразу несколько векторов на одном модельном животном. Он также позволяет сравнивать различные варианты вирусов в одинаковых условиях. Создатели методики протестировали ее при подборе оптимального AAV для доставки генетического материала в клетки сетчатки макаки, а также продемонстрировали принципиальную возможность ее использования для оценки эффективности доставки AAV в клетки мозга, сердца и печени мыши.

Иммунология

2. Циркадные ритмы регулируют миграцию дендритных клеток от кожи в лимфатическую систему, сообщают авторы статьи в Nature Immunology. Цикличность миграции дендритных клеток у мышей обусловлена ритмичными изменениями уровней хемокина CCL21 и адгезивного белка LYVE-1 в клетках лимфатического эндотелия в течение суток. В дендритных клетках наблюдали циркадный ритм в экспрессии рецептора хемокина CCL21 — CCR7. Ритм миграции дендритных клеток отсутствовал у мышей, у которых ген циркадного транскрипционного фактора BMAL1 не экспрессировался либо в дендритных клетках, либо в клетках лимфатического эндотелия. Авторы показали прямую регуляцию экспрессии CCL21, CCR7 и LYVE-1 транскрипционным фактором BMAL1. Ритмичное изменение уровня экспрессии CCL21 и LYVE-1 наблюдали также в образцах биопсии кожи человека. Интересно, что наиболее высокий уровень CCL21 у человека наблюдался утром, а у мыши — вечером, в соответствии с дневным и ночным образом жизни. Предположительно, время суток может влиять на эффективность вакцинации или иммунотерапии рака, говорят авторы статьи.

3. Авторы другой статьи в Nature Immunology обнаружили свидетельства наследования тренированного иммунитета у мышей. Ранее эпигенетическое наследование иммунитета было показано только для растений и насекомых. Исследователи инфицировали самцов мыши нелетальной дозой дрожжевого грибка Candida albicans, а спустя месяц спаривали самцов со здоровыми самками и получали их потомство первого, а затем второго поколения. На небольшой группе животных (пять мышей первого поколения и десять мышей второго поколения с соответствующим числом контрольных животных) авторы отметили уменьшение бактериальной нагрузки в некоторых органах у потомства инфицированных мышей при заражении их Escherichia coli. Наблюдение за вторым поколением потомства исключает эффект прямого воздействия инфекции на половые клетки. Авторы показали изменение транскриптомного профиля у мышей первого поколения и его обогащение мРНК генов, отвечающих за ранний иммунный ответ. В сперме инфицированных грибками самцов был изменен метиломный профиль — в частности, изменения были обнаружены в генах транскрипционных факторов, участвующих в регуляции экспрессии в миелоидных клетках. Каким образом эпигенетические метки могут сохраняться от спермы родителя до костного мозга взрослой мыши, еще предстоит выяснить.

Диагностика и терапия рака

4. Вариант комбинированной терапии метастазов в головном мозге при раке груди был предложен и опробован на мышах группой ученых из Швейцарии, Германии и США. Терапия воздействует на ассоциированные с опухолью макрофаги и микроглию — клетки, которые под влиянием раковых клеток изменяются и начинают поддерживать рост опухоли. Ученые выяснили, что предложенное ранее ингибирование белка CSF1R не вполне эффективно, так как в конечном счете включается адаптивный сигнальный механизм посредством белкового фактора CSF2, что приводит к воспалению. Новая стратегия включила в себя помимо ингибирования CSF1R еще и ингибирование сигнальной молекулы STAT5, принадлежащей пути, опосредованному CSF2. Такая комбинированная терапия увеличила время жизни модельных мышей с раком груди и метастазами в головном мозге. Ингибирование STAT5 позволило избежать воспаления в мозге мышей, а также перепрограммировать ассоциированные с опухолью макрофаги в нормальное состояние, в котором они противодействуют развитию опухоли.

5. Согласно промежуточным результатам международного проспективного исследования IMPACT, ежегодный скрининг уровня простатспецифического антигена (ПСА) в крови эффективен для выявления рака простаты на ранних стадиях у мужчин с синдромом Линча. Это генетическое заболевание, которое обусловлено мутациями в генах MLH1, MSH2, MSH6 или PMS2 и выражается в повышенном риске развития некоторых типов рака. Всеобщий скрининг ПСА не рекомендован, поскольку приводит к большому числу ошибочно поставленных диагнозов. Среди 305 носителей мутированного MSH2 у 4,3% (13 человек) был диагностирован рак простаты, по сравнению с 0,5% (одним человеком) из 210 мужчин контрольной группы. Среди 135 носителей мутаций в MHS6 у 3% (четырех человек) был обнаружен рак простаты, в то время как среди контрольной группы из 177 человек заболевших выявлено не было. Не было выявлено заболевших и в группе носителей мутаций в гене MLH1. Согласно полученным данным, носители мутаций в MSH2 и MSH6 обладают повышенным риском рака простаты, и исследователи рекомендуют для этих людей ежегодный скрининг ПСА.

Терапия вирусных заболеваний

6. Ученые из Медицинского колледжа Альберта Эйнштейна в Нью-Йорке адаптировали запатентованную ранее технологию synTac для создания потенциального способа лечения инфекций, вызванных ВИЧ или цитомегаловирусом. Технология подразумевает создание искусственных synTac-белков, моделирующих поверхность антиген-презентирующей клетки и несущих последовательности пептидов, принадлежащих белкам вируса. Введение synTac-белков вызывает активацию CD8+ T-клеток. Полученные synTac-белки к ВИЧ и цитомегаловирусу вызывали экспансию CD8+ T-клеток ex vivo в мононуклеарных клетках периферической крови. У мышей с гуманизированной иммунной системой введение synTac-белков также вызывало экспансию CD8+ T-клеток. Эти клетки эффективно подавляли соответствующие вирусные инфекции у гуманизированных мышей. Ученые не возлагают больших надежд на то, что таким способом можно полностью элиминировать из организма все ВИЧ-инфицированные CD4+ T-клетки, но рассматривают synTac-терапию как потенциальную альтернативу антиретровирусной терапии.

Эволюция

7. Ученые из Великобритании сделали интересное наблюдение о закономерностях эволюции бактерий. Два варианта бактерии Pseudomonas fluorescens, AR2 и Pf0-2x, содержат мутации, из-за которых они лишены способности передвигаться с помощью флагеллы. Оба варианта подвержены быстрой эволюции, направленной на восстановление функций флагеллы. В то время как у варианта Pf0-2x эволюция идет по разным путям, у варианта AR2 в 95% случаев происходит замена одного и того же нуклеотида A289 гена ntrB. В новом исследовании ученые показали, что синонимичная замена шести нуклеотидов в окрестности A289 у AR2 приводит к тому, что картина эволюции AR2 полностью переворачивается и становится похожа на картину эволюции Pf0-2x — не было обнаружено ни одного события мутации A289. Аналогично, обратная замена этих шести нуклеотидов, не влияющих на последовательность белка, у Pf0-2x приводит к тому, что в 80% случаев происходит мутация все того же нуклеотида A289 гена ntrB (мутации которого не было обнаружено при эволюции исходного Pf0-2x). Таким образом, синонимичные мутации могут приводить к образованию или удалению мутационной «горячей точки». Авторы предположили, что причиной может быть локальное изменение структуры ДНК, но экспериментальных доказательств этому пока нет.

Методы молекулярной биологии

8. Новый метод Repair-seq позволяет комплексно изучать пути репарации двухцепочечных разрывов ДНК в клетке и наблюдать, к каким мутационным исходам приводят разные пути репарации ДНК. Метод основан на технологии CRISPRi, в которой посредством гидовой РНК происходит направленное подавление экспрессии генов. В методе Repair-seq используют библиотеку лентивирусов, каждый из которых несет последовательность гидовой РНК к одному из генов репарационной системы, а также последовательность гена, впоследствии подвергающегося двухцепочечному разрыву. Всего в библиотеку вошли 1513 гидовых РНК к 476 генам, из них 212 — гены с выявленной функцией в репарации ДНК. Через несколько дней после заражения клеток вирусами из библиотеки с помощью нуклеаз, например, Cas9, вносили двухцепочечные разрывы в таргетный ген. Секвенирование позволяет установить связь между подавленным компонентом репарационной системы и исходом репарации таргетного гена. Оказалось, например, что канонические гены негомологичного соединения концов можно разбить в зависимости от исхода репарации на три группы, которые, вероятнее всего, подчеркивают тонкие особенности процесса репарации, связанные с функциями этих генов. Авторы предполагают, что метод будет интересен как для фундаментального исследования систем репарации, так и для изучения исходов генноинженерных манипуляций методами, подразумевающими внесение двухцепочечных разрывов.

Эпигенетика

9. В Genome Research вышла статья об особенностях бивалентного хроматина в эмбриональных стволовых клетках и при раке. Бивалентный хроматин содержит одновременно модификации H3K4me3 и H3K27me3, которые обычно ассоциированы с активным и неактивным хроматином, соответственно. Авторы опровергли гипотезу, согласно которой бивалентный хроматин способствует быстрой активации экспрессии. При дифференцировке эмбриональных стволовых клеток активация экспрессии генов в участках бивалентного хроматина происходила не быстрее и не в большей степени, чем в участках только с модификацией H3K27me3 или вообще без модификаций H3K4me3 или H3K27me3. Основной функцией бивалентного хроматина авторы считают поддержание обратимо неактивного состояния хроматина. Бивалентный хроматин с высокой вероятностью (90%) характерен для участков ДНК, на которых сосредоточено большое количество CpG и которые содержат модификацию H3K27me3. При анализе 14 типов рака оказалось, что «бивалентные» в эмбриональных стволовых клетках гены чрезмерно представлены среди генов, гиперметилированных при раке. Около 2/3 генов, гиперметилированных в раковых клетках, являлись «бивалентными» в эмбриональных стволовых клетках. В нераковых дифференцированных клетках различных типов 31% «бивалентных» генов эмбриональных стволовых клеток остается «бивалентными», 52% сохраняют только модификацию H3K4me3 и лишь 10% сохраняют только H3K27me3.

Древние геномы

10. В Nature опубликованы результаты большого метагеномного исследования 535 образцов пород вечной мерзлоты и озерных отложений из разных частей Арктики, включая Северную Европу, Сибирь, Северную Америку, Гренландию и острова Северного Ледовитого океана. Период, охваченный в исследовании, — последние 50 тысяч лет. Анализировали параллельные изменения флоры и фауны этого периода, включающего в себя максимум последнего оледенения и выход из него. Авторы (в их числе и российские ученые) выяснили, что во время оледенения флора Арктики была довольно однородной (характерная для тундростепи). В голоценовую эру начало появляться большее разнообразие флоры в разных регионах Арктики. Заболачивание негативно повлияло на разнообразие фауны, а сохранение участков тундростепи в Сибири способствовало более долгому сохранению крупных животных — мамонтов до 3,9 тысяч лет назад и шерстистых носорогов до 9,8 тысяч лет назад. Влияние человека на вымирание этих видов, скорее всего, было минимальным, так как вымирание происходило в зависимости от изменения флоры и ландшафта. Кроме того, исследование выявило ранее не обнаруженную митохондриальную линию у мамонтов. Обнаружили также ДНК, предположительно принадлежащие древним арктическим верблюду и льву, но пока с точностью утверждать это нельзя.

11. Международная команда из 162 ученых предложила свой сценарий происхождения современной домашней лошади. Ранее предполагали, что ее предки жили в Центральной Азии, где были обнаружены самые древние археологические свидетельства одомашнивания лошадей. Но геномные исследования показали, что геном современной лошади значительно отличается от генома тех лошадей. В новом исследовании были проанализированы древние геномы 273 лошадей со всей Евразии, датированные от 50 000 до 200 лет до н. э. Домашние предки современных лошадей впервые появились на территории Причерноморско-Каспийских степей между 2000 и 2200 годами до н.э. и затем в течение нескольких столетий вытеснили другие виды одомашненных лошадей от Атлантического побережья до Монголии. Гипотеза о том, что распространение лошадей происходило в процессе массовой миграции населения в Европу с распространением индоевропейских языков, была отвергнута, так как волна такой миграции приходилась примерно на 3000 лет до н.э. и происходила раньше, чем распространение лошадей.

Этика исследований

12. Ученые из 31 страны обсудили в Nature этическую сторону вопроса работы с человеческими останками. Исследования древних геномов начались с 2009 года и слабо регулируются. При этом такие исследования поднимают вопросы национальной идентичности и в некоторых случаях могут способствовать обострению межнациональных конфликтов или поднимать болезненные вопросы. Ученые пишут о том, что не может быть общей рекомендации по проведению таких исследований, однако в любом случае необходим тесный диалог со всеми возможными заинтересованными сторонами в лице национальных сообществ. В ходе международного семинара по этике, прошедшего 4 и 5 ноября 2020 года, были сформулированы пять основных правил проведения исследований ДНК древних людей:

1) Исследование должно соответствовать всем предписаниям, установленным в тех местах, откуда были получены останки и где проводится исследование.

2) Исследование должно проводиться по заранее разработанному плану (в него входит формулирование главного вопроса исследования, способ обращения с останками, план возвращения останков тем, кто их предоставил, а также форма публикации результатов).

3) Исследователи должны минимизировать ущерб останкам при взятии образцов.

4) Полученные геномные данные должны быть доступны после публикации результатов работы для ее проверки.

5) Исследователи должны вовлекать всех заинтересованных лиц и убедиться, что исследование проводится с уважением и чуткостью к их интересам.

Геном человека

13. Статья в Nature сообщает о завершении проекта по секвенированию и анализу 454 787 экзомов из UK Biobank. Более чем в 95% случаев глубина покрытия секвенирования составила 20X. Исследователи идентифицировали 12 миллионов вариантов в кодирующих последовательностях и проверили их на ассоциации с 3994 аспектами, связанными со здоровьем. Такие ассоциации были обнаружены для 564 генов. До сих пор не было аналогов новой базы, объединяющей в себе огромное количество экзомов, кодирующих вариантов и подробной информации о фенотипах обладателей геномов, что открывает возможности для изучения функций генов в новом масштабе.

Геномы редких животных

14. Компания Dovetail Genomics и организация по охране дикой природы Revive & Restore объявили об открытии второго проекта по программе «A Genome for…» (AG4). В рамках первого проекта программы им удалось собрать финансирование на секвенирование генома вымирающей рыбки из Индонезии. Теперь они намерены в рамках краудфандинговой компании собрать деньги на секвенирование генома росомахи. Второй проект называется «A Genome for Laura» по имени самки росомахи. Несмотря на уменьшение популяции, росомаха не входит в список исчезающих видов США из-за недостаточных данных об их численности. Наличие полногеномных данных позволит следить за популяцией росомахи, надеются организаторы проекта.