Воскресное чтение. Обзор научной периодики за 4–10 октября

Атласы клеток мозга, лиганды из ДНК-оригами, измеряющие расстояния между рецепторами Т-клеток, антибиотик от бореллиоза, новый аналог Cas9 в транспозонах, разоблачение «бактерицидных свойств» паутины и многое другое. 

Художник:
Наталья Дюкова

Нейробиология

1. В спецвыпуске Nature на этой неделе опубликованы 17 статей, которые представляют данные проекта BRAIN (Brain Research through Advancing Innovative Neurotechnologies) по созданию самых полных каталогов и карт клеток мозга. Это результат работы по грантам общей суммой более 7 миллиардов долларов, выделенным в 2013 году американским правительством и Европейской комиссией. Инициативу поддержали также Япония, Канада, Южная Корея и Китай. Консорциум закартировал около 1% клеток мозга мыши и планирует закончить эту работу к 2023 году. Клеточные типы моторной коры сравнили у мыши, макаки и человека. У мыши описали коннектом — связи между нейронами моторной коры. В основном атласы основываются на транскриптомных и метиломных данных секвенирования единичных клеток мозга, а также на данных о морфологии и физиологии клеток. Метод Patch-seq позволил получить все эти данные из одних и тех же клеток: сначала индивидуальные нейроны выделяли и анализировали их электрофизиологические свойства, затем заполняли красителем для анализа морфологии, а на последнем этапе секвенировали генетический материал из клеточных ядер. Члены консорциума надеются, что итогом проекта станет реконструкция связей в мозге и раскрытие механизмов нейрозаболеваний.

2. В регуляции воспоминаний о страхе участвует пептид, который отвечает за высвобождение гормона гастрина специфическими клетками желудка — бомбезинподобный гастрин-высвобождающий пептид (gastrin-releasing peptide, GRP). Его функции во многих отделах коры головного мозга ранее были непонятны. Исследователи из США выяснили, что GRPR, рецептор GRP, является модулятором специфического типа клеток коры — нейронов, экспрессирующих вазоактивный интестинальный пептид (VIP). Эти клетки, в частности, контролируют пластичность сетей нейронов внутри разных отделов коры. Связывание GRP с его рецептором на мембране VIP-клеток (а в коре мозга этот рецептор экспрессируют главным образом они) растормаживает их — вызывает деполяризацию, повышение уровня кальция в клетке, мгновенные изменения в экспрессии генов других нейромодуляторов и активацию пирамидальных клеток коры через другие типы нейронов.

VIP-клетки входят в проводящие пути, соединяющие таламус, кору и миндалевидное тело, которые отвечают за восприятие страха. Исследователи наблюдали повышение уровня кальция в VIP клетках мышей после неожиданных громких звуков. А у мышей, нокаутных по GRP или его рецептору, ухудшалась память о страхе, которую оценивали в поведенческих тестах как число реакций замирания в ответ на звук. Таким образом, VIP клетки с помощью пептидергической системы интегрируют информацию о новых шоковых сигналах. Хотя исследовалась только слуховая кора, авторы предполагают, что аналогичные связи между GRP и VIP-клетками действуют и в других зонах.

3. Ученые из Швейцарии описали механизм ранней стадии зависимости от тяжелых наркотиков. Разные наркотики действуют на различные молекулярные мишени, но пути привыкания сходятся на повышении уровня дофамина в прилежащем ядре головного мозга, которое играет важную роль в формировании удовольствия. Начало зависимости у грызунов характеризуется локомоторной сенсибилизацией – стадией повышенной двигательной активности. Авторы статьи исследовали изменения тока кальция в клеточных популяциях прилежащего ядра у мышей, происходящие уже после первого приема наркотика. В состав прилежащего ядра входят игольчатые проекционные нейроны (spiny projection neurons), которые делятся на субпопуляции в зависимости от типа дофаминовых рецепторов на них. После первого приема кокаина активность нейронов из субпопуляции D1R повышалась, а D2R — угнеталась, после второго приема эффект становился еще более явным. Также обнаружилось, что после фармакологического подавления сигнального пути киназы ERK в клетках D1R сенсибилизация не наблюдается. Не все эти нейроны напрямую отвечают за движения, что говорит о более сложной природе локомоторной сенсибилизации.

Иммунология

4. ДНК-оригами помогли понять, как пространственная организация лигандов рецепторов Т клеток в кластеры усиливает их активацию. Для активации Т-клетки требуется сборка сложного белкового комплекса, состоящего из ее рецептора, корецептора CD3 и других коактиваторов, и молекул главного комплекса гистосовместимости на антигенпрезентирующей клетке. В журнале PNAS представлено прямое доказательство того факта, что пространственная скученность рецепторов увеличивает локальную концентрацию ферментов-коактиваторов, снижает число локальных ингибиторов и тем самым запускает положительную обратную связь.

Авторы статьи заменили нативные Т-клеточные рецепторы на химерные антигенные рецепторы DNA-CARζ, состоящие из ζ-цепи CD3, трансмембранного домена CD86 и внеклеточного белка, ковалентно связанного с одноцепочечной молекулой ДНК. Эта ДНК, как рецептор, связывает комплементарный ей одноцепочечный ДНК-лиганд на поверхности трехмерной ДНК-структуры (ДНК-оригами), что запускает фосфорилирование рецепторного комплекса Т-клетки и активирует ее. ДНК-оригами, несущие лиганды, были иммобилизованы на стекле с шагом в несколько нанометров, эта матрица давала возможность конструировать различные паттерны лигандов. Таким образом было показано, что повышенная плотность ДНК-лигандов усиливает активацию Т-клеток, а связывание более слабых (менее комплементарных) лигандов может способствовать более сильной активации в ответ на полностью комплементарные. Полученные результаты можно будет использовать в инженерии химерных антигенных рецепторов и их лигандов для иммунотерапии.

5. При химиотерапии опухолей метастазы могут быть вызваны повышением уровня эйкозаноидов — окисленных производных 20-углеродных полиненасыщенных жирных кислот; некоторые вещества этой группы выполняют функции нейромедиаторов и гормонов. Происходит это из-за гибели опухолевых клеток. Остатки клеток (дебрис) стимулируют экспрессию генов фермента эпоксидгидролазы (sEH), отвечающего за их синтез, и рецептора 4 простагландина E2 (EP4). В результате активируются опухолевые макрофаги, развивается цитокиновый шторм и воспаление, опухоль метастазирует. Процесс регулируется положительной обратной связью, поскольку активированные макрофаги также выбрасывают эйкозаноиды. Авторы статьи, опубликованной в PNAS, показали, что совместная фармакологическая блокада sEH и EP4 не только подавляет цитокиновый шторм, но и провоцирует опухолевых макрофагов фагоцитировать клеточный дебрис. Ингибиторы sEH и антагонисты EP4 могут подавлять метастазы рака печени и поджелудочной железы.

Антимикробные вещества

6. Известный антибиотик продемонстрировал селективное действие против возбудителя болезни Лайма. Зоонозную болезнь Лайма (бореллиоз) вызывает спирохета Borreliella burgdorferi. Против нее обычно применяют антибиотики широкого спектра действия — доксициклин, амоксициклин и цефтриаксон, которые нарушают кишечную микробиоту пациента. Группа американских ученых предположила, что почвенные актиномицеты могут продуцировать вещества, активные против спирохет. Проведя скрининг экстрактов из 452 видов актиномицетов против B. burgdorferi, они обнаружили эффект от 24, из которых шесть оказались подавляли рост бореллий, но не других бактерий. Один был получен из хорошо изученного Streptomyces hygroscopicus. С помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии из экстракта выделили антибактериальное вещество, которым оказался открытый в 1953 году антибиотик гигромицин А. Выяснилось. что он высокоселективен в отношении спирохет, в то время как другие бактерии, такие как E. coli, устойчивы к нему. Антибиотик связывается с 23S рибосомной РНК и блокирует пептидилтрансферазный центр бактериальной рибосомы, который консервативен у всех бактерий. Специфичность его действия объясняется транспортом: за проникновение гигромицина А в клетку отвечает транспортер пуриновых нуклеотидов BmpD, который имеется у спирохет и отсутствует у E. coli и других устойчивых бактерий. Гигромицин А вылечил мышей от инфекции B. burgdorferi, при этом не снизив разнообразия кишечной микробиоты. Специфичность и возможность орального приема позволяют предположить, что он обеспечит лучшее лечение болезни Лайма, чем препараты, применявшиеся до сих пор.

7. Ученые из Дании опровергли антибактериальные свойства паутины. В некоторых медицинских руководствах встречаются сведения об использовании паутины для заживления ран и защиты их от патогенных микроорганизмов. В исследовании паутина семи видов пауков не оказала влияния на рост бактерий, как грамположительных (Bacillus subtilis), так и грамотрицательных (Escherichia coli, Pseudomonas putida). Необработанную паутину либо экстракты из нее помещали на чашки Петри с агаром, на котором росли бактерии, и не обнаружили никаких признаков гибели бактериальных клеток. Результаты не исключают наличия бактериостатических свойств у паутины других видов пауков или избирательного действия на другие микроорганизмы. Уникальные физические свойства паутины — высокая прочность на разрыв и гибкость — могут найти применение в медицине, но ее следует использовать в комбинации с эффективными антисептическими средствами, например, искусственными антибактериальными пептидами.

Эмбриональное развитие

8. Каннабиноиды могут отрицательно влиять на эмбриональное развитие и обладать тератогенным эффектом, сообщает журнал Development. Они ингибируют сигнальный путь Hedgehog (HH), который отвечает за морфогенез переднего мозга, конечностей и пальцев, вентральной части нервной трубки. Одним из последствий нарушений в HH является голопрозэнцефалия (циклопия) — состояние, в котором полушария головного мозга не разделяются. Тетрагидроканнабинол вызывал сходные с голопрозэнцефалией дефекты у эмбрионов мышей, так как блокировал один из компонентов пути HH — белок smoothened. Действие его при этом не опосредовано специфическими каннабиноидными рецепторами. Это означает, что если беременная женщина употребляет психоактивные средства, содержащие каннабиноиды, последствия могут быть более серьезными, чем представлялось ранее.

9. Авторы статьи в журнале Current Biology описали молекулярные отличия в развитии конечностей саламандры и других тетрапод. Саламандры могут регенерировать конечности после повреждений, но на этом различия не заканчиваются. У большинства позвоночных конечность закладывается в порядке от центра тела к периферии (вначале локтевая и большеберцовая кости, затем лучевая и малоберцовая, затем в аналогичном порядке пальцы). У саламандр же, единственных из позвоночных, процесс идет в обратном порядке. Палеонтологические данные показали, что порядок закладки, типичный для саламандр, был предковым для всех позвоночных, и всего один ген современных позвоночных 5’Hoxd обращает развитие конечности в современный тип. Этот ген активирует сигнальный путь Hedgehog и является антагонистом гена Gli3R. В отсутствие 5’Hoxd репрессия пути HH вызывает преждевременный выход клеток латеральной части почки конечности из клеточного цикла на путь дифференцировки, что и объясняет закладку от периферии к центру. Искусственное подавление экспрессии репрессора Gli3R у аксолотля меняет порядок закладки на противоположный.

10. Нематода Caenorhabditis elegans кормит своих личинок желтком — процесс, схожий с лактацией. Взрослые гермафродитные особи нематоды начинают стареть спустя несколько дней после достижения половой зрелости: ткани кишечника деградируют путем аутофагии и превращаются в желток. Продукция желтка продолжается и после прекращения репродуктивных функций и регулируется инсулиноподобным фактором роста IGF-1, который в том числе уменьшает продолжительность жизни нематоды. При этом желток выделяется в окружающую среду и служит кормом для личинок. Ученые показали сходство протеома молока человека и желтка червей, несмотря на отсутствие близкого эволюционного родства. Это исследование может служить примером взаимосвязи процессов репродукции и старения.

Высокопроизводительные методы

11. Разработали метод, позволяющий одновременно измерять уровень белка и экспрессию генов в единичных клеточных ядрах in vivo. Изучение активности генов основано на присутствии в ядре белков-регуляторов — транскрипционных факторов (ТФ) — и изменении экспрессии молекул РНК в ответ на них. Новый метод inCITE-seq позволяет одновременно оценить содержание ТФ в ядре с помощью антител, меченных индивидуальным ДНК-баркодом, и экспрессию в этом ядре с помощью РНК-секвенирования. Ядра разделяют на единичные в каплях жидкости, а затем секвенируют в них РНК и баркоды антител, отражающие содержание одного или нескольких ТФ. Эти два параметра соотносят между собой линейными моделями, которые показывают направление регуляции ТФ его генов-мишеней. На примере клеток гиппокампа мыши в состоянии инсульта показали, что изменяющие экспрессию гены делятся на несколько регуляторных модулей в зависимости от четырех ТФ-регуляторов.

12. Новый метод предсказания экспрессии генов на основе глубоких сверхточных нейросетей показал лучшие результаты, чем его предшественники. Особенно это касается предсказания влияния удаленных некодирующих районов ДНК, где благодаря сложной 3D архитектуре генома могут находиться энхансеры. Программа Enformer была обучена на более чем 30 тысячах наборов полногеномных данных человека и мыши, содержащих последовательности связывания транскрипционных факторов, данные о модификациях гистонов и доступности хроматина. Модель предсказывала энхансеры лучше, чем предыдущие, что показало сравнение ее результатов с экспериментальными данными CRISPR-интерференции (метода анализа регуляторных районов генома, когда белок Cas9 препятствует посадке транскрипционного фактора на определенную последовательность ДНК). Кроме того, модель идентифицирует инсуляторные районы хроматина (границы топологических доменов) и предсказывает локусы в регуляторных районах ДНК, вариации в которых могут быть ассоциированы с заболеваниями.

Хронобиология

13. Биологические часы из цианобактерий собрали in vitro, сообщается в Science. Циркадные часы в цианобактериях подстраивают экспрессию генов согласно суточному световому циклу. В этом участвуют три белка Kai, две нижестоящие киназы SasA и CikA и регулируемый ими транскрипционный фактор RpaA. Днем один из белков, KaiC, фосфорилируется при участии KaiA, а ночью KaiC способствует дефосфорилированию. Ученые изучили систему вне сложного клеточного контекста. Она включала все компоненты часов, сшитые с флуоресцентными зондами, которые позволяли следить за белок-белковыми взаимодействиями, а также промотор гена-мишени RpaA, отражающий регуляцию часами нижележащих процессов. Часы работали автономно в течение нескольких дней. Оказалось, что киназы SasA и CikA не только передают сигнал от часов дальше, но и сами играют роль в их настройке, способствуя сборке комплексов белков Kai. Система позволила понять связь биохимии часов и фенотипа клетки, а кроме того, она открывает перспективу использования осциллятора в искусственных клетках.

CRISPR и его родственники

14. Предшественника нуклеаз системы CRISPR сотрудники Вильнюсского университета нашли в транспозонах. Руководитель этой работы — Виргиниюс Шикшнис, один из пионеров CRISPR. Инсерционные последовательности (IS) прокариот — одни из самых простых мобильных генетических элементов. Они несут только гены, необходимые для собственного перемещения по геному: фермент-транспозазу tnpA, которая вырезает и вставляет транспозон на новое место, и часто второй ген trnpB, чьи функции были не изучены до недавнего времени. Биоинформатический анализ показал, что tnpB может быть предковой последовательностью для нуклеаз Cas9/Cas12.

На примере элемента ISDra2 из бактерии Deinococcus radiodurans исследователи показали, что tnpB действительно кодирует ДНК-нуклеазу, направляемую длинной некодирующей РНК, чей ген также находится внутри ISDra2. Подобно нуклеазам Cas, TnpB тоже разрезает последовательность с 5’-конца от 5-нуклеотидной последовательности TTGAT, названной транспозон-ассоциированным мотивом (TAM). Эта последовательность соответствует той, что необходима для встройки транспозона ISDra2 транспозазой TnpA.

Ученые опробовали TnpB в качестве новой системы генного редактирования на клетках HEK293T. Частота мутаций составила 10–20%, что сравнимо с технологиями CRISPR. В то время как TnpA отвечает за вырезание и встраивание, TnpB выполняет скорее регуляторную функцию, препятствуя неудачному вырезанию транспозона или его потере путем гомологичной рекомбинации. После вырезания транспозон оставляет «след», в котором есть TAM и комплементарная гидовой РНК последовательность. Благодаря этому IS может быть вставлен обратно на свое место.

Новости компаний

15. Компания Synthego, которая специализируется по генному редактированию,  подает в суд на Agilent Technologies, чтобы предотвратить обвинения в нарушении патентных прав на синтетические гидовые РНК для CRISPR. Компания подала иск в суд Северного округа Калифорнии, в котором заявляется, что продукты Synthego под названием CRISPRevolution не нарушают патенты Agilent на гидовые РНК с химическими модификациями. Synthego призывает не давать возможности Agilent заявлять о нарушении патента, а также потребовать от нее возместить судебные исдержки. По версии Synthego, в июне вице-директор Agilent предложил компании приобрести лицензию на запатентованные технологии гидовых РНК, однако в этих патентах отсутствует инновационность.

Добавить в избранное

Вам будет интересно