Жидкостная и цифровая цитология — современный подход к диагностике и профилактике рака шейки матки

erid: 2VfnxxWdS7J

Первой выступила Антонина Зинина, руководитель направления клиническая лабораторная диагностика ООО «ИЛС», с докладом «Цитология в постановлении по репродуктивному здоровью». Она подчеркнула, что законодательство важно знать и специалистам КЛД, и врачам клиницистам.

В декабре 2023 года вышло постановление Правительства РФ №2353, в котором говорится о диспансеризации, направленной на оценку репродуктивного здоровья женщин и мужчин. Программа федеральная, следовательно, будет действовать во всех регионах России. К документу приведены методические рекомендации, описывающие порядок действий на каждом этапе скрининга.

Согласно этим рекомендациям, в первый этап обследования женщин входит:

• прием врача-акушера-гинеколога

• осмотр наружных половых органов

• осмотр влагалища и шейки матки в зеркалах, с забором материала на исследование

• бимануальное влагалищное исследования

• пальпация молочных желез

• визуальное исследование молочных желез;

• микроскопическое исследование влагалищных мазков;

• определение pH;

• цитологическое исследование микропрепаратов шейки матки и цервикального канала (важно, что это два обязательных исследования);

ИЛИ

• жидкостное цитологическое исследование микропрепарата шейки матки (женщины до 29 лет — 1 раз в 3 года, до 49 лет — 1 раз в 5 лет);

• определение инфекций NCMT методом ПЦР (всем женщинам 18-29 лет).

(Полужирным выделены позиции, обсуждаемые на симпозиуме.)

Для мужчин на первом этапе предусмотрено:

• заполнение анамнестической анкеты;

• осмотр пациента врачом-урологом.

Согласно постановлению №2353, цитологическое исследование микропрепарата с шейки матки и цервикального канала или жидкостное цитологическое исследование в рамках программы допускается только с окраской по Папаниколау. Исследование осуществляется в соответствии с Национальным стандартом РФ (ГОСТ Р 57004-2016) «Диагностика в онкологии. Алгоритм диагностики. Шейка матки. Лабораторный этап» и клиническими рекомендациями уже для врачей-гинекологов «Цервикальная интраэпителиальная неоплазия, эрозия и эктопия шейки матки» (2020 год).

Каждая лаборатория может выбирать между традиционной и жидкостной цитологией. Сравним.

Традиционная цитология — это:

• два стекла на одну женщину — в два раза больше нагрузка на цитологов;

• мазки необходимо фиксировать спиртом в течение 30 секунд после взятия для качественной окраски по Папаниколау. Не все гинекологи соблюдают это правило, что увеличивает число неадекватных препаратов.

Жидкостная цитология — это:

• одно стекло на одну женщину — нагрузка на цитологов ниже;

• гинеколог просто скидывает щеточку в виалу, что исключает ошибки в фиксации и обеспечивает отличную окраску по Папаниколау.

В клинических рекомендациях 2020 года «Цервикальная интраэпителиальная неоплазия, эрозия и эктопия шейки матки» рекомендуют использовать жидкостную цитологию, так как около 10% традиционных цитологических мазков являются неадекватными.

Выполнение массового скрининга требует надежного и автоматизированного решения. Один из примеров такого решения — система жидкостной цитологии EASYPREP (Южная Корея). Прибор работает по принципу центрифугирования в градиенте плотности с последующей седиментацией на стекло с адгезивным покрытием. Система сама удаляет кровь и слизь из препаратов и выдает чистый препарат. Время просмотра препаратов снижено, возможно использование систем цифровизации препаратов. Одновременно можно поставить 64 виалы.

Кроме гинекологической цитологии, EASYPREP поможет с подготовкой монослойных препаратов щитовидной железы, молочной железы, выпотов, препаратов биопсий и мочи. Система соответствует всем стандартам и рекомендациям, действующим на данный момент. Подробнее познакомиться с прибором можно на сайте easyprep.ru.

На втором этапе обследования женщин цитологии уже нет. Он включает:

• определение инфекций NCMT методом ПЦР (30-39 лет): Neisseria gonorrhoeae, Chlamydia trachomatis, Mycoplasma genitalium, Trichomonas vaginalis;

• определение ВПЧ (раз в 5 лет);

• УЗИ матки и придатков;

• УЗИ молочных желез;

• прием врача-акушера-гинеколога.

Если мужчина решится пожаловаться на неприятные симптомы во время первого приема, то он сможет получить расширенное обследование:

• определение инфекций NCMT (Neisseria gonorrhoeae, Chlamydia trachomatis, Mycoplasma genitalium, Trichomonas vaginalis) и Ureaplasma urealyticum методом ПЦР;
  

• определение инфекций методом ПЦР: Candida albicans, Gardnerella vaginalis, Human Papilomavirus, Mycoplasma homonis;

• спермограмма;

• УЗИ предстательной железы и органов мошонки.

Сейчас существуют коммерческие наборы ПЦР-реагентов, которые позволяют за одну постановку определить наличие нескольких возбудителей в мазке. Мужчины могут сдавать и мазок из уретры, и мочу.

Анализ на ВПЧ можно сделать из той же виалы, которая использовалась для жидкостной цитологии. Среда в виале предотвращает денатурацию белков, высыхание и ухудшение качества образца, сохраняет морфологическую структуру клеток. Образцы в консервирующем растворе хранятся до 4 недель при комнатной температуре или до 3 месяцев в холодильнике.

Возникает вопрос: какой именно анализ ВПЧ делать? По клиническим рекомендациям для гинекологов следует выполнять исследование на всю группу ВПЧ высокого онкогенного риска (не менее 12 генотипов) всем женщинам в возрасте от 30 до 65 лет; таким образом может быть выявлена группа риска предрака и РШМ. Делать только 16 и 18 генотипы неправильно. В России доступны наборы на определение 14 генотипов. У ВПЧ негативных женщин анализ проводится каждые 5 лет, у ВПЧ положительных — ежегодно. В выполнении массовых цитологических и ПЦР исследований может помочь EASYPREP.

С докладом «Возможности жидкостной цитологии в улучшении качества цитологических исследований» выступила Гульнара Лёшкина (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора). Она рассказала о клиническом случае, который был ретроспективно отслежен на протяжении двух с половиной лет наблюдения за пациенткой.

В декабре 2021 года на исследование поступил цервикальный соскоб, приготовленный традиционным методом, от женщины 53 лет с 18 типом ВПЧ (lg 5,5); направительный диагноз — «обследование, эндометриоз». Традиционной цитологией с окраской по Романовскому выявлены AGC (Atypical glandular cells/атипичные клетки железистого эпителия, Бетесда). На снимках докладчик продемонстрировала характерные морфологические паттерны в виде «розеток» из железистых эндоцервикальных клеток. Через месяц по результатам жидкостной цитологии цитологический диагноз AGC был воспроизведен.

Январь 2022 г. Гинекологом выполнена биопсия шейки матки; гистологическое заключение — АIS (аденокарцинома in situ). В микроскопическом описании: «Деформированные фрагменты шейки матки, в одном из которых имеется очаг аденокарциномы in situ». После биопсии врач акушер-гинеколог провел выскабливание цервикального канала; гистологическое заключение: «Фрагменты шейки матки с выраженными коагуляционными изменениями, многослойный плоский неороговевающий эпителий с признаками койлоцитоза, без признаков дисплазии. В толще цервикальные крипты с цервикальной гландулярной неоплазией 2-3 степени. Однозначно высказаться о краях резекции не представляется возможным из-за коагуляционных изменений». В препаратах пациентки наблюдалось разрастание желез, в которых присутствовали клетки с вытянутыми гиперхромными ядрами; стромальная инвазия отсутствовала.

Аденокарцинома in situ зачастую бывает случайной находкой при патоморфологическом исследовании. При кольпоскопии ее не всегда можно увидеть, если нет эрозированной поверхности. Обычно АIS имеет мультифокальный генез. При АIS наблюдаются:

• замена нормального эпителия на патологический на поверхности эндоцервикса и в ранее существовавших эндоцервикальных железах;

• резкий переход от нормального к атипичному эпителию от железы к железе и внутри отдельных желез;

• отсутствие десмопластической стромальной реакции и минимальный воспалительный инфильтрат.

Аденокарциномы in situ делятся на ВПЧ-зависимые (обычный тип, кишечный, трубчатый и муцинпродуцирующий) и ВПЧ-независимые (желудочный тип).

Возвращаясь к анализу истории обследований пациентки: в апреле 2022 года повторная жидкостная цитология дала результат AGC. В препарате наблюдались клетки с овальными и вытянутыми ядрами, с розеткоподобным расположением клеток в группах, с «выпрыгивающими» ядрами по типу «пера птицы», что является характерным признаком железистых неопластических поражений.

Май 2022 г. Новая биопсия шейки матки по результатам цитологии AGC и сохраняющейся персистенции ВПЧ 18 типа. Получено заключение: «Фрагменты эндоцервикса без признаков атипии в пределах исследованного материала». Возникает закономерный вопрос: пациентка здорова? Но ВПЧ 18 типа остается... что, безусловно, является плохим прогностическим фактором.

Июль 2022 г. Вирусная нагрузка ВПЧ 18 типа - lg 5,8. При плоскоклеточном раке шейки матки чаще всего встречается ВПЧ генотип 16 (62%), а при инвазивной аденокарциноме около 40% приходится на генотип 18. Цитологи решают пересмотреть препараты. В галерее клеток видят те же паттерны железистого поражения: группы клеток в виде розеток с «выпрыгивающими» «перьевидными» ядрами, расположение клеток по типу «крыла птицы» - все те же патогномоничные признаки неоплазии железистого типа. Эти признаки позволяют цитологу поставить диагноз «АIS».

К сожалению, аденокарциному нередко пропускают как в гистологии, так и в цитологии. Возможно, дело в том, что цитолог сосредотачивается по преимуществу на поиске изменений в клетках плоского эпителия. Это и понятно, поскольку частота плоскоклеточных раков выше, чем железистых, в примерном соотношении 80% и 20%. При аденокарциномах высокодифференцированных морфология клеток очень сходна с нормальными зрелыми клетками эндоцервикса. Однако при аденокарциномах как in situ, так и с инвазией, практически всегда обильно представлен субстрат опухоли. Цитолог Гульнара Лёшкина советует обращать внимание на гиперклеточность железистого эпителия и характерные кластеры клеток («розетки», «полоски») — они могут помочь в дифференцировании злокачественных клеток от нормальных.

Март 2023 г. На основании результата цитологии AIS и персистенции ВЧП 18 типа выполнена конизация шейки матки. Диагноз гистологический: «Эпителий без признаков дисплазии. ИГХ не проводилось. Хронический активный цервицит, цервикальная эктопия, ретенционные кисты».

Июль 2023 г. Диагноз по результатам жидкостной цитологии — дисплазия легкой степени (LSIL). Вирусная нагрузка ВПЧ 18 типа - lg 5,4. Врач проводит кольпоскопию, но при обработке шейки матки раствором Люголя признаков патологии нет. Можно успокоиться и наблюдать как LSIL? Соответственно, гинеколог приглашает пациентку на следующий прием через полгода.

Январь 2024 г. Вирусная нагрузка ВПЧ 18 типа lg 5,6. Диагноз в цитологии вновь AGС, уже с субклассификацией AGС NOS (атипичные железистые клетки неясного значения). В галерее клеток есть все признаки эндоцервикального поражения (препарат выполнен на системе жидкостной цитологии EasyPrep), хотя предыдущий результат полгода назад был LSIL. Воспроизводимость результатов цитологии далека от 100%, и это тоже нужно учитывать гинекологам…

Февраль 2024 г. Вирусная нагрузка ВПЧ 18 типа lg 6,4. Диагноз AGС с субклассификацией AGС FN (атипичные клетки железистого эпителия, возможно, неоплазия). В препаратах те же «розетки» и «крыло птицы» (препарат выполнен на системе жидкостной цитологии EasyPrep). Снова конизация шейки матки и снова в заключении - хронический цервицит, лейкоплакия шейки матки.

Апрель 2024 г. Препарат от июля 2023 г. цитологи пересмотрели и нашли признаки АIS (препарат выполнен на системе жидкостной цитологии EasyPrep). Консилиум цитологов подтвердил, что это аденокарцинома in situ. По результату пересмотра цитологического препарата, врачом-гинекологом было запрошено второе экспертное мнение по материалам конусовидной эксцизии в марте 2023 г., и его результат… AIS!

Накануне выступления цитолог Гульнара Лёшкина связалась с врачом. После пересмотра гистологии и установления диагноза «аденокарцинома in situ», пациентке лапароскопически удалили матку. Однако окончательное патологоанатомическое заключение оказалось следующим: «Эндометриальный полип, аденомиоз, лейомиома тела матки; злокачественного опухолевого роста в шейке матки при тотальном ее исследование не выявлено».

Гульнара Витальевна резюмировала: к сожалению, нередко в операционном материале не находят патологических участков, которые присутствовали в биопсии или эксцизии, и все участники диагностического поиска могут испытывать определенное разочарование. Однако бонусом для специалистов, участвовавших в лечении и диагностике данной пациентки стал тот факт, что на первом контрольном обследовании после проведенной операции ВПЧ-тест был уже отрицательным! Приведенный клинический случай показал, как важно междисциплинарное взаимодействие специалистов — цитологов, гинекологов, патоморфологов, молекулярщиков. Длительная персистенция ВПЧ высокого канцерогенного риска может быть надежным предиктором тяжелого поражения. Главное — держать связь с клиницистом. Результаты цитологического и гистологического исследования зависят от множества факторов: важен комплексный подход!

С заключительным докладом «Трудности в цитологии, которых можно избежать» выступил Андрей Сепп (Лаборатория «Гемотест», заведующий патологоанатомическим отделением).

Жидкостная цитология, по мнению Андрея Сеппа, — технология будущего. Вопрос только в сроках. Если на PubMed набрать запрос «жидкостная цитология», то найдется около трех тысяч статей с пиком публикаций, приходящимся на 2011 год. Большинство из них посвящены именно методике. Даже сейчас в новых статьях зачастую обсуждается, как сделать хороший препарат.

Технологии жидкостной технологии в России схожи с зарубежными: у нас те же ThinPrep, SurePath, EasyPrep и CellPrep. Преимущества жидкостной цитологии — это:

• получение стандартизированных монослойных препаратов;

• возможность изготовления нескольких весьма близких по клеточному составу монослойных препаратов (серии) из одного и того же биоматериала пробы;

• высокая сохранность клеточных структур (по сравнению с традиционной технологией) — клетки лучше сохраняют морфологические, молекулярно-биологические свойства;

• уменьшение «фона» цитологического препарата;

• возможность использования одной пробы для параллельного котестирования;

• длительный срок хранения исследуемого материала — не менее 14–21 дня.

Из недостатков можно упомянуть следующие:

• увеличение стоимости расходных материалов;

• нужна площадь для хранения расходных материалов и установки прибора;

• появляется потребность в ликвидации отходов класса Б;

• увеличение времени подготовки препарата;

• иногда диагностика патологии основывается на небольшом числе патологических клеток.

Текущая производительность в лаборатории Гемотест — 25-28 тысяч цитологических исследований в месяц. Из них на жидкостную цитологию приходится 6-7 тысяч исследований в месяц. Для жидкостной цитологии используют автоматизированную систему EASYPREP. Если в него загрузить все реагенты и расходные материалы, то через два часа прибор выгрузит готовые стекла. Время занятости лаборанта за весь цикл — около 10 минут.

В погоне за полной автоматизацией выходят и подводные камни. У системы есть модуль окрашивания препаратов, но окраска занимает 20-25 минут, что увеличивает время прогона. За рабочий день при таком подходе можно успеть поставить только два цикла, а это всего 128 окрашенных стекол.

Решением может быть выносная автоматизированная окраска препаратов. Внешний стейнер позволит:

• окрашивать серии препаратов по унифицированным, но различным протоколам, оптимизированным под разный тип препаратов (с различной клеточностью, тропностью к красителям и др.);

• проводить процесс окрашивания уже готовых мазков параллельно работе цитопроцессора, т.е. вынести процесс окраски из приборов пробоподготовки и цитопроцессора;

• очень гибко настраивать процедуру окраски, в том числе по «нетипичным» протоколам;

• возможно совмещение процессов окраски и заключение препаратов под покровное стекло/пленку.

Процедура ручного окрашивания останется актуальной при любом количестве автоматических стейнеров. В лаборатории «Гемотест» около 0,7–0,9% монослойных препаратов окрашивается мануально. Это порядка 60–70 препаратов в месяц. Обычно ручное окрашивание используют, если препараты:

• со сниженной или повышенной тропностью к красителям;

• с большим количеством жира;

• с сильно деградированными структурами (после длительного хранения);

• необходимы «редкие» цитохимические окраски (PAS, по Циль-Нильсену и другие).

Пап-тест и жидкостная цитология связаны с окраской по Папаниколау. В России эта окраска не является доминирующей. Процесс кажется многостадийным и сложным, часто окраска может не получиться, и тогда непонятно, как интерпретировать результаты, такая окраска дороже и требует влажной фиксации. Начинающие цитологи могут столкнуться со следующими проблемами:

• Зеленый препарат. Если после окраски в ЕА50, цитоплазма окрашивается в оранжевый и зеленый, а не в розовый, оранжевый и зеленый, нужно разбавить OG6 или уменьшить время экспозиции.

• Оранжевый препарат. Окраска в OG6 и EA50 взаимозависимы. Слишком длительная окраска в OG6 (>1 мин) и слишком короткая окраска в ЕА50, приводят к тому, что красный цвет заменяется на оранжевый.

Но если один раз настроить в лаборатории окраску, то это не составляет проблемы, а на выходе цитолог получает красивый препарат с сохранной морфологией, с хорошей градацией тонов и цветов, дифференциацией всех структур. На жидкостной цитологии можно даже разглядеть ворсинки на клетках. В заключение Андрей Сепп подчеркнул, что жидкостная цитология — базовая технология для иммуноцитохимии и цифровой цитологии, и за ней будущее.

Информация о докладчиках

Зинина Антонина Николаевна, ведущий специалист по продвижению продукции ООО «ИнтерЛабСервис»

Лёшкина Гульнара Витальевна, биолог ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, член международной академии цитологии (PMIAC), эксперт РАГИН, сертифицированный тренер Cintec Plus

Сепп Андрей Валентинович, к.м.н, заведующий патологоанатомическим отделением «Лаборатория Гемотест», член РООП

Реклама. Рекламодатель ОOO «ИЛС» ИНН 7720263905