Аденоассоциированные вирусные векторы для генной терапии сетчатки вызывают иммунный ответ

В 1996 году был открыт способ доставки генов в клетки сетчатки с помощью аденоассоциированного вируса (AAV). С тех пор было проведено несколько клинических испытаний AAV-опосредованной генной терапии — ее тестировали на пациентах с врожденным амаврозом Лебера (LCA), хороидеремией и возрастной дегенерацией сетчатки. Предварительные результаты указывали на безопасность вирусных векторов, а также улучшение зрения у пациентов. Однако в долгосрочной перспективе было обнаружено вторичное ухудшение зрения в подвергнутом инъекции глазу. Выдвигались разные гипотезы, объясняющие такие результаты, среди них запрограммированная гибель клеток сетчатки из-за дегенеративного процесса, усиление реакции хозяина на нуклеиновые кислоты, индуцирующее посттранскрипционные регуляторные механизмы в воспалительных условиях, и активация ответа адаптивного иммунитета на клетки, экспрессирующие продукт трансгена, или на капсидные антигены вирусного вектора.

С иммунологической точки зрения глаз представляет собой особый орган, в котором могут быть вызваны протолерогенные иммунные реакции. Иммунопатология передней камеры глаза (ACAID) — это механизм, при котором антиген, введенный в переднюю камеру глаза, захватывается и обрабатывается антигенпрезентирующими клетками (APC), которые мигрируют через кровь в тимус и селезенку и генерируют протолерогенные клетки (например, регуляторные Т- или В-клетки). Несколько лет назад аналогичный механизм был описан для субретинального пространства (субретинально-ассоциированное иммунное ингибирование, SRAII). При SRAII антиген, введенный в субретинальное пространство, вызывает системное антиген-специфическое ингибирование ответов CD4⁺ и CD8⁺ Т-клеток. Тем не менее, введение антигена может вызывать провоспалительные реакции. Эти данные позволяют предположить, что некоторые формы иммунных реакций могут быть вызваны локально или на расстоянии и эффективно нацелены на клетки глаза, экспрессирующие продукт трансгена или капсидные антигены. Однако возможные механизмы индукции иммунных реакций в генной терапии для глаз остаются плохо изученными.

Ученые из Франции смоделировали и охарактеризовали периферические анти-трансгенные Т-клеточные иммунные реакции, вызванные субретинальной инъекцией AAV-вектора. Они показали, что инъекция AAV8 в субретинальное пространство одного глаза вызывает субклинические периферические провоспалительные Т-клеточные иммунные реакции на продукт трансгена, коррелирующие с уровнем экспрессии трансгена в глазу и на периферии. Более того, совместная инъекция иммунодоминантных пептидов из трансгена, независимо от дозы AAV8, подавляла Т-клеточные иммунные реакции на продукт трансгена как в физиологических, так и в патологических моделях мышей.

В качестве модели исследователи использовали мужской антиген HY и его пептиды UTY и DBY. Этот антиген позволяет имитировать введение экзогенного антигена в самок мышей. Эпитопы UTY и DBY были слиты либо с зеленым флуоресцентным белком (GFP), либо с люциферазой 2 (Luc2) для отслеживания экспрессии трансгена. Серотип AAV8 был выбран, так как он все чаще используется для нацеливания на сетчатку. Проанализировав результаты инъекции векторов AAV8-GFP-HY самкам на 21-й день, ученые обнаружили, что средние и высокие дозы AAV8 (2×10⁹– 5×10¹⁰ вирусных геномов), введенные в субретинальное пространство, вызывают зависимую от времени провоспалительную Т-клеточную иммунную реакцию на трансген на периферии.

Затем ученые оценили, как уровень экспрессии трансгена влияет на иммунный ответ. Они субретинально вводили PBS, пептиды HY или различные дозы AAV8-Luc2-HY. Средние (4×10⁸– 2×10⁹ вирусных геномов) и высокие (5×10¹⁰– 10¹¹ вирусных геномов) дозы AAV8 вызывали дозозависимую экспрессию трансгена с 3-го дня после инъекции. На 21-й день авторы проанализировали содержание интерферона гамма (IFNγ). Относительное число клеток, секретирующих IFNγ, коррелировало с локальной экспрессией трансгена в тканях головы. Экспрессии трансгена на периферии при низких дозах AAV8 векторов не наблюдалось, тогда как дозы, превышающие 2×10⁹ векторов, явно вызывали экспрессию трансгена на периферии, особенно в печени. Это распространение трансгена по периферии может объяснять индукцию провоспалительной иммунной реакции высокими дозами AAV8, введенными субретинально.

Исследователи оценили возможность использования механизма SRAII в качестве инструмента иммуномодуляции при субретинальном переносе генов с помощью AAV, сопроводив введение вирусного вектора инъекцией самих пептидов, закодированных трансгеном. Окзалось, что коинъекция иммунодоминантных пептидов подавляла Т-клеточный иммунный ответ на трансген и снижала количество клеток, секретирующих IFNγ. Оценка уровней других цитокинов показала, что инъекция AAV в субретинальное пространство вызывает провоспалительный ответ, ориентированный на Т-хелперы/Т-киллеры 1 типа (IL-2, IFNγ, TNFα и GM-CSF), который может быть подавлен стратегией SRAII независимо от дозы AAV. In vivo эксперименты на мышиной модели прогрессирующей дегенерации сетчатки показали, что доза AAV в 2×10⁹ вирусных геномов увеличивала долю клеток, секретирующих IFNγ. Таким образом, SRAII может также быть индуцирован в контексте дегенерации сетчатки.

Данное исследование показало, что субретинальная инъекция аденоассоциированного вирусного вектора AAV8 вызывает дозозависимый системный ответ CD4⁺ и CD8⁺ Т-клеток, направленный на продукт экспрессии трансгена и коррелирующий с уровнем его местной и периферической экспрессии. При этом одновременная субретинальная коинъекция AAV и эпитопов трансгена способна снижать иммунный ответ.

Белок IRAK-M замедляет возрастную дегенерацию сетчатки