Анализ выдыхаемого воздуха выявляет инфекции нижних дыхательных путей

Традиционно для диагностики инфекций нижних дыхательных путей (ИНДП) — бронхита, пневмонии и т.д. — применяют культуральный метод, который позволяет выделить и идентифицировать патоген. Однако он требует значительных затрат ресурсов и занимает много времени. В последние годы активно развиваются альтернативные методы диагностики ИНДП на основе амплификации нуклеиновых кислот, однако они не позволяют отличить инфекцию от безвредной колонизации дыхательных путей бактериями. Ученые из компании Zeteo Tech (США) и коллабораторы предложили еще один подход к диагностике ИНДП с помощью детекции протеаз в выдыхаемом воздухе.

При ИНДП активируются нейтрофилы, которые вырабатывают протеазы и провоспалительные цитокины. Ученые выбрали мишенью своего анализа эластазу нейтрофилов — сериновую протеазу, которая содержится как в бронхоальвеолярной жидкости, так и в выдыхаемом воздухе. Они разработали синтетический субстрат эластазы нейтрофилов, который состоит из трех частей. Основу субстрата составляет пептид из неканонических аминокислот, который имеет высокое сродство к эластазе нейтрофилов. С C-конца к пептиду присоединена малая молекула — производное кумарина, которая облегчает взаимодействие субстрата с протеазой, а на N-конце пептида находится линкер из полиэтиленгликоля (ПЭГ), который обеспечивает точное узнавание сенсора — продукта расщепления субстрата — с помощью масс-спектрометрии.

Выдыхаемый пациентами воздух ученые забирали с помощью специального устройства BreathBiomics, в котором содержащиеся в воздухе протеазы инкубировались с субстратом. Полученный в результате их взаимодействия продукт детектировали с помощью MALDI-TOF масс-спектрометрии — быстрого и надежного метода, который позволяет количественно определить эластазу нейтрофилов. Весь анализ проводится in vitro и неинвазивен.

Для начала ученые проверили метод на рекомбинантной мышиной и человеческой эластазе нейтрофилов. Оказалось, что продукт расщепления субстрата эластазой можно детектировать уже через 10 мин инкубации при 37℃. Сам сенсор был высокоспецифичным к эластазе нейтрофилов: при инкубации с ней получался продукт, который не детектировался при использовании других протеаз — протеиназы 3 и катепсина G. Предел детекции рекомбинантной человеческой эластазы нейтрофилов составил 0,04 пМ после инкубации субстрата с протеазой в течение 24 часов при 37℃.

Метод также апробировали при участии здоровых контролей и пациентов неврологического отделения интенсивной терапии больницы Джонса Хопкинса. С помощью протеомного анализа исследователи подтвердили присутствие эластазы нейтрофилов в воздухе, выдыхаемом пациентами с ИНДП — в основном с пневмонией, ассоциированной с применением аппарата ИВЛ. С помощью устройства BreathBiomics ученым удалось различить пациентов с ИНДП и здоровых пациентов. Они показали, что при ИНДП средняя концентрация эластазы нейтрофилов равна 0,27 нМ, в то время как предел чувствительности метода гораздо ниже.

Точность метода — показатель AUC — составила 0,987. Таким образом, по мнению ученых, устройство BreathBiomics действительно может использоваться для диагностики ИНДП. При предельном значении концентрации эластазы нейтрофилов в 0,2 пМ чувствительность метода была равна 1, а специфичность — 0,867.

В дальнейшем ученые планируют расширить панель детектируемых протеаз до 80 белков. При этом они отметили, что хотят учитывать как молекулы, выделяемые патогенами, так и молекулы, которые выделяются организмом пациента, что позволит сделать диагностику более точной. Они намерены использовать свой метод для диагностики отдельных ИНДП, а также для мониторинга течения болезни после применения антибиотиков.

Пациенты на ИВЛ могут быть скрытым резервуаром Acinetobacter baumannii и Candida auris