Бактериальный сенсор «выключает» флуоресценцию в ответ на стресс

Кишечник человека — динамическая среда, в которой pH, содержание кислорода и осмоляльность влияют на состав микробиоты. В свою очередь, кишечная микробиота тесно связана с состоянием здоровья, поэтому отслеживать изменения этих показателей важно для диагностики заболеваний кишечника и понимания их этиологии. Однако неинвазивных инструментов мониторинга по-прежнему недостает.

Авторы статьи в Cell разработали флуоресцентный биосенсор на основе комменсальной бактерии кишечника — Bacteroides thetaiotaomicron. Штаммы этой бактерии перспективны для такой задачи, но возможность управляемой экспрессии репортера в них ограничена, поскольку нативные промоторы не обеспечивают высокого уровня экспрессии флуоресцентных белков. В предыдущих биосенсорах использовалась люминесценция, сигналы которой нельзя детектировать с разрешением в одну клетку и мультиплексировать. 

Предложенная система основана на опосредованном контроле экспрессии репортера. В ответ на внешний стимул в бактериальной клетке усиливается синтез синтетического репрессора, подавляющего нативный промотор бактерии. Это снижает уровень экспрессии зеленого флуоресцентного белка (GFP) под контролем данного промотора. Для поправки на общие колебания экспрессии авторы добавили в систему конститутивно экспрессируемый красный флуоресцентный белок (RFP).

Авторы получили три библиотеки промоторов, регулируемых репрессорами TetR, LacI и PhlF. По итогам скрининга библиотек они выбрали репрессируемый промотор PT_etR56 и TetR. 

Затем ученые подобрали нативные промоторы B. thetaiotaomicron, которые специфично индуцируются в ответ на осмотический стресс. Они протестировали четыре распространенных осмолита, которые могут попадать в кишечник с пищей или фармпрепаратами: хлорид натрия, сорбитол, лактулозу и полиэтиленгликоль (ПЭГ). Всего было отобрано пять наиболее перспективных кандидатов, запускавших транскрипцию генов-мишеней in vitro и in vivo (в кишечнике мышей, колонизированных только B. thetaiotaomicron) в ответ на осмотический стресс.

Под контролем выбранного промотора авторы расположили ген tetR, а мишень этого репрессора — P_TetR56 — контролировала экспрессию GFP. Три из пяти собранных конструкций (для дальнейших экспериментов авторы выбрали две) отвечали на повышение осмоляльности in vitro, однако уровни GFP были ниже, чем в контроле без репрессора. Это указывает на фоновую экспрессию TetR, которая может ограничивать динамический диапазон биосенсора. Связывание свободного TetR специальными лигандами-«губками», действительно, улучшала характеристики биосенсора in vitro. Дополнительного усиления авторы добились, интегрировав кодирующую биосенсор конструкцию в геном бактерии с помощью гомологической рекомбинации. 

Затем ученые протестировали биосенсор in vivo. Они измерили его ответ на тяжелую мальабсорбцию (нарушение всасывания в тонком кишечнике), вызванную полиэтиленгликолем. Мыши в течение шести дней получали 10% или 15% ПЭГ. Средняя осмоляльность в слепой кишке у них была повышена по сравнению с контролем (550 и 650 мОсм/кг против 375 мОсм/кг). Активацию сенсора оценивали по соотношению сигналов GFP и RFP, измеренных методом проточной цитометрии. 

Как и ожидалось, в отрицательном контроле активации не происходило, тогда как у мышей, получавших 10% и 15% ПЭГ, сенсор демонстрировал 55,1- и 48,3-кратную активацию. 
Биосенсор выявлял и мягкую мальабсорбцию еще до появления явных клинических симптомов, таких как разжижение стула. Чтобы смоделировать это, ученые в течение трех дней давали мышам 1%, 2,5%, 5% или 7,5% ПЭГ, после чего собрали образцы слепой кишки и кала. Анализ выявил постепенную активацию сенсора в ответ на увеличение осмоляльности (вплоть до 40-кратной у мышей, получавших 5–7,5 % ПЭГ).

Однако предыдущие опыты проводили на мышах, лишенных собственной микробиоты — их кишечник был колонизирован только генноинженерной B. thetaiotaomicron. Ученые проверили пригодность биосенсора в более реалистичных условиях и ввели его обычным мышам. За семь дней уровень колонизации достиг 10⁵–10⁶ колониобразующих единиц (КОЕ) на мл образца стула и оставался стабильным в течение четырех недель. Экспрессия обоих флуоресцентных белков наблюдалась более чем в 90% колоний. 

Авторы показали, что сигнал биосенсора временный и обратимый, измерив его активацию до, во время и после воздействия ПЭГ. К третьему дню осмоляльность в слепой кишке у мышей, получавших ПЭГ, возросла с 400 до 500 мОсм/кг, что сопровождалось 21-кратной активацией биосенсора. Через три дня после того, как исследователи перестали давать мышам ПЭГ, осмоляльность слепой кишки и сигнал биосенсора вернулись к исходному уровню и оставались стабильными в течение как минимум еще трех дней.

Таким образом, флуоресцентный биосенсор, сигнал которого «выключается» в ответ на осмотический стресс, способен детектировать его воздействие на микробиом кишечника. Он реагировал на изменения осмоляльности in vivo в различных условиях — как при колонизации только самим штаммом-сенсором, так и в смешанных микробных сообществах, причем детектировать сигнал можно было еще до появления клинических симптомов. 

Кожный трансплантат светится в ответ на воспаление