Бактерий научили перерабатывать пластик в полезные продукты

Загрязнение окружающей среды пластиком стремительно растет во всем мире, оказывая негативное воздействие на экологию и здоровье человека. Одно из заманчивых решений этой проблемы — переработка пластмасс с помощью генноинженерных микроорганизмов, однако эта задача остается сложной из-за многоступенчатости самого процесса. Авторы недавней статьи в Nature Communications предложили использовать с этой целью искусственное микробное сообщество, которое будет поэтапно разлагать гидролизат полиэтилентерефталата (ПЭТФ), распространенного варианта пластмассы.

Разработки в этой области велись и раньше, однако существующие подходы к переработке пластика с помощью монокультур сталкиваются с рядом проблем, обусловленных сложностью переработки полимеров. Во-первых, при полной деполимеризации ПЭТФ образуется смесь терефталевой кислоты (ТФК) и этиленгликоля (ЭГ), неоднородная по своим физико-химическим характеристикам — одновременная утилизация этих субстратов затруднительна. Во-вторых, продукты деполимеризации, такие как гидролизат ПЭТФ, нередко ингибируют микробный метаболизм, мешая эффективной переработке. В-третьих, переработка пластиковых отходов в полезные продукты требует многоступенчатых ферментативных путей, которые может быть затруднительно «уместить» в отдельные штаммы. Ученые предположили, что решить эти проблемы помогут микробные сообщества, в которых отдельные этапы переработки пластика будут осуществляться разными микроорганизмами.

Исследователи получили сообщество из двух штаммов почвенной бактерии Pseudomonas putida, которые по отдельности специализируются на ассимиляции ТФК и ЭГ, соответственно. Их совместная активность обеспечивала полную утилизацию гидролизата ПЭТФ. Для сравнения ученые также создали один, метаболизирующий ТФК и ЭГ одновременно.

Штамм, утилизирующий ТФК (Pp-T) получили из P. putida, отключив ассимиляцию этиленгликоля и обеспечив возможность метаболизировать ТФК. Первое было достигнуто путем удаления из генома родительского штамма EM42 оперона ped — это исключало окисление этиленгликоля. Для обеспечения метаболизма ТФК в геном этих бактерий также ввели оперон tpa, который кодирует большую и малую субъединицы терефталат-1,2-диоксигеназы (tpaAa и tpaAb), редуктазную субъединицу (tpaB), дигидродиолдегидрогеназу (tpaC) и транспортер (tpaK). Это обеспечивает превращение ТФК в протокатехат, который затем может утилизироваться бактерией.

Другой штамм, специализирующийся на этиленгликоле (Pp-E), получили из уже ассимилирующего ЭГ штамма, удалив из генома транскрипционный репрессор gclR глиоксилат-карболигазного пути. Это увеличивало углеродный поток от глиоксилата к пирувату. Кроме того, ученые заменили нативный промотор оперона гликолятоксидазы (glcDEF) на сильный конститутивный вариант и внедрили искусственный сайт связывания рибосом. Такие модификации призваны усилить метаболизм этиленгликоля.

 Метаболические пути микробного сообщества для переработки ПЭТФ, состоящего из двух штаммов Pseudomonas putida: Pp-T и Pp-E. Pp-T, лишенный оперона ped и конститутивно экспрессирующий оперон tpa, нужен для утилизации терефталевой кислоты. Напротив, Pp-E специализируется на деградации этиленгликоля, что достигается усилением экспрессии генов глиоксилат-карбоксилазного пути.
Credit:
Nature Communications (2023). DOI: 10.1038/s41467-023-40777-x | CC BY

Исследователи протестировали оба штамма на способность утилизировать целевой субстрат, как по отдельности, так и вместе. Они показали, что штамм Pp-T использовал ТФК в качестве единственного источника углерода и израсходовал 56,2 мМ TPA в течение 36 часов. Этот штамм также был способен расти в присутствии 316 мМ TPA, что свидетельствует о высоком уровне толерантности к этому соединению. Как и ожидалось, этиленгликоль он не утилизировал и был малочувствителен к его присутствию, в отличие от родительского штамма.

Штамм Pp-E, напротив, не потреблял ТФК, но эффективно использовал этиленгликоль в качестве единственного источника углерода. По сравнению с родительскими штаммами у Pp-E значительно улучшились показатели роста и потребления ЭГ, а накопление промежуточных метаболитов было незначительным. Этот штамм также оказался толерантен к высокому уровню ЭГ.

Затем авторы работы исследовали утилизацию субстратов совместной культурой Pp-T и Pp-E. В присутствии только ТФК или ЭГ сообщество демонстрировало те же особенности ферментации, что и монокультуры Pp-T и Pp-E. Однако в присутствии сразу двух субстратов микробное сообщество эффективно и полностью катаболизировало оба.  Также при этом за 48 часов нарастала значительная биомасса, в отличие от монокультур. Кроме того, ученые подтвердили, что кокультура двух штаммов перерабатывала смесь ТФК и ЭГ эффективнее, чем отдельный штамм, способный к метаболизму обоих соединений. Полученные результаты подтверждают успешную разработку искусственного микробного сообщества для совместной утилизации ТФК и этиленгликоля.

Для практического применения разработки авторы предложили интегрированный процесс, сочетающий химический гидролиз с микробным разложением. Он включает три этапа: ПЭТФ подвергают щелочному гидролизу для деполимеризации, приготовляют из него ростовую среду и затем проводят в ней ферментацию. Предложенный подход не требует сложных технологических условий или дополнительных этапов очистки.

Исследователи также показали, что микробную утилизацию пластмассы можно применять для биосинтеза различных ценных соединений. Введением дополнительных этапов они добились получения цис-цис муконовой кислоты и полигидроалканоатов со средней длиной цепи (C6–C14).

В совокупности авторы разработали интегрированный процесс разложения порошкообразного пластика до микробной биомассы с помощью микробного сообщества, а также продемонстрировали возможность биосинтеза целевых продуктов с помощью утилизирующего ПЭТФ микробного сообщества. 

Арктические микроорганизмы разлагают пластик при низких температурах