Быстрый тест выявит возбудителя пародонтита в слюне

Пандемия COVID-19 продемонстрировала эффективность и удобство систем иммунохроматографического анализа (ИХА, lateral flow assay) для диагностики в местах оказания медицинской помощи (без отправки образцов в специализированную лабораторию). Полученный опыт повысил интерес к разработке ИХА-систем для диагностики других заболеваний. В новой статье ученые из США представили ИХА тест-систему для диагностики пародонтита по образцам слюны.

Бактерия Porphyromonas gingivalis является одним из основных возбудителей хронического пародонтита — воспаления тканей, окружающих зуб. P. gingivalis, как и другие грамотрицательные бактерии, содержит в клеточной стенке большое количество липополисахаридов (LPS), которые высвобождаются при гибели клетки и функционируют как эндотоксин, провоцируя иммунный ответ и развитие воспаления. Существует ряд методов для обнаружения LPS в ротовой полости, которые, однако, не обладают желаемой портативностью для применения в местах оказания медицинской помощи.

Авторы разработали две ИХА-системы сэндвичного типа. В первом варианте образец смешивается с буфером, содержащим моноклональные антитела, связанные с золотыми наночастицами (AuNP). После инкубации смесь наносится на тестовую систему, на которой присутствуют две полосы — тестовая, представленная поликлональными антителами, и контрольная, представленная белком G. В случае присутствия в образце LPS он связывается с антителами в буфере и, как следствие, с AuNP, функционирующими как маркер. Далее в процессе движения смеси по тестовой системе происходит связывание LPS с антителами на тестовой полосе, что приводит к образованию видимой красной полосы. Несвязанные с LPS комплексы антител с AuNP связываются белком G на контрольной полоске, также формируя видимую полосу. Во второй версии системы используются только поликлональные антитела, а комплекс антитело-AuNP заранее помещается на тестовую систему, что снимает необходимость в продолжительной (порядка 40 минут) инкубации. Подобный дизайн тест-системы возможен за счет того, что LPS представляет собой крупную молекулу, обладающую большим числом сайтов для связывания антител.

В опытах с водным раствором, содержащим LPS, тест-системы обнаруживали концентрации выше около 22 нг/мл. Выраженность тестовой полосы линейно возрастала с концентрацией LPS в растворе и достигала пика при 10–20 мкг/мл.

Несмотря на отличную работу с водными растворами, при использовании образцов слюны с добавлением LPS на тест-системах не проявлялась ни тестовая, ни контрольная полоса. Авторы предположили, что одно из биоактивных веществ в слюне препятствует функционированию теста. Дальнейшие опыты показали, что нанесение на тест-систему водного раствора, содержащего LPS и α-амилазу (один из содержащихся в слюне ферментов) приводит к такому же результату, что и использование образцов слюны. Таким образом, перед учеными встала задача удаления α-амилазы из образцов.

Очевидным решением проблемы могла бы стать ультрафильтрация с применением фильтров Amicon, которые эффективно удалят биомолекулы. Однако большой размер молекул и агрегатов LPS означает, что они бы отфильтровывались вместе с α-амилазой. Прохождение образцов через фильтры с большим размером пор (0,2 и 0,45 мкм) привело к образованию видимых полос на тесте, выраженность которых, тем не менее, была меньше, чем в опытах с водным раствором.

Ранее было показано, что картофельный крахмал может применяться для удаления α-амилазы. Действительно, инкубация образцов слюны с картофельным крахмалом с последующим центрифугированием приводила к формированию выраженных полос на тест-системе. Однако также присутствовало неспецифическое связывание вне тест- и контрольной полосок, а образец двигался неравномерно. Эти артефакты удалялись при фильтрации образца после инкубации с крахмалом через 0,45 мкм поры. Комбинированная обработка образца слюны крахмалом и фильтрацией позволила обнаружить LPS в образцах слюны в концентрациях выше 46,5 нг/мл. Тест также показал высокую специфичность к P. gingivalis.

Таким образом, авторы представили функциональную тест-систему, выявляющую LPS в слюне, которую можно применять в местах оказания медицинской помощи — методика не требует дополнительного оборудования. Дальнейшие модификации системы могут быть направлены на расширение спектра обнаруживаемых молекул. Авторы также отмечают, что разработанный протокол предварительной обработки образцов слюны может быть использован в других тест-системах.

Геномные аномалии, вызывающие умственную отсталость, выявляет анализ слюны