CAR T-клетки можно дистанционно «включать» и «выключать» малыми молекулами
Швейцарские ученые разработали iONØ-CAR Т-клетки, которые дистанционно «включаются» и «выключаются» с помощью лекарств. В CAR, разделенный на две цепочки, добавили белок Bcl-2, который димеризуется при добавлении венетоклакса. iONØ-CAR Т-клетки активируются только в присутствии этого препарата и опухолевого антигена. Под действием другого препарата — талидомида и его производных — Т-клетки инактивируются.

CAR T-терапия показала многообещающие результаты при лечении раков крови, но терапия солидных опухолей до сих пор сопряжена со множеством проблем. Среди них — чрезмерная активация CAR Т-клеток, которая может приводить к синдрому высвобождения цитокинов, и истощение Т-клеток, снижающее время их персистенции в кровотоке. Швейцарские ученые предложили новый подход к решению этих проблем за счет внедрения в состав CAR Т-клеток белкового «переключателя», который может активировать и инактивировать Т-клетки дистанционно под действием нужных лекарств.
Обычно CAR для Т-клеток состоят из одной цепи. Однако ученые разделили их на две цепи, которые могут димеризоваться для активации Т-клетки. Такие CAR состоят из рецепторной R-цепи и сигнальной S-цепи, и предполагается, что эти цепи димеризуются при связывании малой молекулы. В качестве основы цепочек таких CAR ученые использовали Bcl-2 — антиапоптотический белок. Он может образовывать гомодимеры, если с ним связываются проапоптотические BH3-белки. Это свойство ученые и использовали, но, чтобы вызвать димеризацию, применяли малую молекулу венетоклакс, препарат для лечения лейкоза.
Ученые получили сразу несколько линий индуцибельных CAR Т-клеток — их назвали (i)ON-CAR. В R-цепочку CAR включили вариабельный домен антитела против таргетного опухолевого антигена, белок Bcl-2, шарнирный и трансмембранный домены CD8α, а для костимуляции использовали 41BB. В S-цепочку также вошел белок Bcl-2, сшитый с c-Myc (использовался как метка), шарнирный и трансмембранный домены CD8α, а также 41BB и CD3ζ для передачи сигнала об активации Т-клеток. Эффективность (i)ON-CAR ученые проверили на разных опухолях: например, нацеливали клетки против EpCAM или PSMA в раке простаты, против CD19 в лейкемии.
Исследователи показали, что (i)ON-CAR Т-клетки активируются и вырабатывают интерферон-гамма, которым убивают опухолевые клетки, только в присутствии венетоклакса. В in vivo экспериментах на мышах с подкожными опухолями такие Т-клетки тоже были активны только при одновременном введении венетоклакса. На активность обычных Т-клеток препарат не оказывал никакого влияния, в отсутствие таргетного антигена (i)ON-CAR Т-клетки тоже не активировались вне зависимости от наличия венетоклакса. Однако исследователи отметили, что при слишком высоких концентрациях препарата (5 мкМ — это наибольшая концентрация венетоклакса, которая не является токсичной для опухолевых клеток сама по себе) многие клетки уходили в апоптоз.
Ученые также показали, что через некоторое время после того, как венетоклакс убирали из среды, такие Т-клетки сами переходили в неактивное состояние. Так, через 24 часа после удаления венетоклакса выработка интерферона-гамма снижалась на 50% и сводилась к нулю через 48 часов. Если же потом венетоклакс добавляли повторно, то клетки реактивировались. Правда, в некоторых случаях и в отсутствие венетоклакса клетки продолжали вырабатывать интерферон, но в очень малых количествах.
На следующем этапе ученые решили разработать «выключатель» Т-клеток. Для этого они ввели в С-конец S- и R- цепей CAR дегроны — последовательности, которые помечают белок для протеасомной деградации. Для активации такого «выключателя» требуется вводить талидомид или его производные (леналидомид или помалидомид), которые улучшают активность E3 убиквитинлигазы. Она, в свою очередь, помещает на дегрон убиквитиновую метку. CAR Т-клетки, которые можно выключать талидомидом, ученые назвали iONØ-CAR Т-клетками.
Авторы показали, что в присутствии леналидомида в среде iONØ-CAR Т-клетки не только не активировались (не вырабатывали интерферон-гамма), но и даже не детектировались по Fab-фрагментам на CAR. Это значит, что CAR с дегронами успешно уничтожаются в протеасоме под действием леналидомида. На инактивацию iONØ-CAR Т-клеток требовалось относительно немного времени после добавления леналидомида: от 4 до 6 часов. Если в среду добавляли не только леналидомид, но и венетоклакс, iONØ-CAR Т-клетки все равно оставались нефункциональными, несмотря на наличие димеризуемого домена.
Далее ученые представили еще один in vitro эксперимент, который доказывает, что iONØ-CAR Т-клетки можно «включать» и «выключать», меняя лекарства. iONØ-CAR Т-клетки активировались в присутствии целевых опухолевых клеток, если в среду добавляли венетоклакс. Когда в нее также добавляли леналидомид, Т-клетки «выключались». Если после этого проходило некоторое время, и в среде снова был венетоклакс без леналидомида, то при новой встрече с опухолевыми клетками Т-клетки снова «включались» и атаковали раковые клетки.
Авторы предполагают, что их подход поможет избежать развития синдрома высвобождения цитокинов и истощения Т-клеток, так как их можно будет просто «выключить» на время, чтобы затем реактивировать.
Источник:
Attianese G., et al. Dual ON/OFF-switch chimeric antigen receptor controlled by two clinically approved drugs. // PNAS (2024). DOI: 10.1073/pnas.2405085121