CRISPR-тест на ДНК микобактерии в крови подходит для пациентов с ВИЧ

Для диагностики туберкулеза, как правило, используют образцы мокроты. Однако такой подход плохо работает для детей из-за трудностей со сбором биоматериала и для ВИЧ-инфицированных пациентов, так как в их мокроте слишком низкая бактериальная нагрузка. Кроме того, анализ мокроты неэффективен при внелегочной форме туберкулеза.

В новой работе ученые из США, Эсватини (Свазиленда) и Кении адаптировали флуоресцентный анализ на основе CRISPR-Cas12a для выявления внеклеточной ДНК M. tuberculosis в крови. Для реакции нужны нуклеаза Cas12a, гидовая РНК и субстрат нуклеазы — олигонуклеотидные зонды, сшитые с флуорофором и тушителем. При связывании с ДНК-мишенью нуклеаза активируется и разрезает зонд, тушитель перестает взаимодействовать с флуорофором и формируется флуоресцентный сигнал. Интенсивность сигнала зависит от концентрации ДНК-мишени. Версия анализа, нацеленная на элемент IS6110, который встречается только в геномах микобактерий туберкулезного комплекса, получила название CRISPR-TB.

Метод проверили на криоконсервированных образцах крови, полученных от двух когорт пациентов. Первая когорта, сформированная в Эсватини, состояла из 73 взрослых и детей без ВИЧ. В ней туберкулез считался подтвержденным при положительных результатах микробиологического исследования мокроты и/или ПЦР-теста. Отдельно группировали случаи туберкулеза, выявленного по симптомам и рентгенологическим данным. Во вторую когорту вошли 153 ребенка из Кении, госпитализированных с ВИЧ. Эти дети систематически проверялись на туберкулез по расширенной схеме: оценивались симптомы, результаты ПЦР, микробиологических и биохимических тестов, а также собирались данные о контактах.

В когорте из Эсватини было 30 человек с подтвержденным туберкулезом, четыре клинически диагностированных случая и 39 контролей. Чувствительность и специфичность CRISPR-TB для взрослых достигала 96% и 94% соответственно. Для детей чувствительность была ниже — 84%, однако специфичность оставалась на уровне 95%. Интересно, что CRISPR-TB обнаружил и внелегочные формы туберкулеза. Также ученые заметили, что флуоресцентный сигнал в среднем был слабее, если у человека болезнь протекала бессимптомно.

В когорте из Кении CRISPR-TB дал положительный результат для всех детей с подтвержденным туберкулезом (13 из 13) и 80% детей с неподтвержденным диагнозом (52 из 65), в том числе для четырех из пяти детей с внелегочной формой инфекции.

В этой же когорте ученые обнаружили прогностическую ценность концентрации внеклеточной ДНК M. tuberculosis в крови. Умершие дети, как правило, имели более высокие исходные уровни внеклеточной ДНК, чем дети, прожившие шесть и более месяцев с начала наблюдения. Более того, анализ сыворотки 51 ребенка до и после начала противотуберкулезного лечения выявил почти трехкратное снижение концентрации ДНК микобактерии. У большинства их них изменение этого показателя детектировалось через месяц терапии.

По мнению ученых, CRISPR-TB — многообещающая платформа для диагностики туберкулеза, не зависящей от мокроты. Особенно важна ее эффективность для выявления педиатрического и ВИЧ-ассоциированного туберкулеза. Кроме того, с помощью CRISPR-TB можно оценивать эффективность лечения по уровню микобактериальной ДНК в крови.