Диагностическая система на основе CRISPR типа III выявляет РНК коронавируса

Группа ученых из США разработала новый метод идентификации РНК-мишени с помощью системы на основе CRISPR типа III. Они подобрали вспомогательные нуклеазы и модифицировали методику так, чтобы она состояла всего из двух шагов — захвата РНК и детекции сигнала без этапов амплификации и выделения нуклеиновых кислот. Чувствительность метода составила порядка 15 фМ, ее проверили путем обнаружения РНК SARS-CoV-2 в двух респираторных мазках от пациентов.

Credit:
123rf.com

В настоящее время «золотым стандартом» для обнаружения нуклеиновых кислот остается количественная ПЦР. Однако этот метод требует сложного оборудования, обученного персонала и правильной транспортировки образцов для исследования. Преодолеть эти ограничения может помочь диагностика с использованием CRISPR-систем (CRISPR-dx). Для обнаружения вирусных геномов эта технология используется с 2016 года (тогда идентифицировали различные варианты вируса Зика). Метод был основан на преобразовании вирусной РНК в ДНК с использованием обратной транскриптазы, изотермической амплификации ДНК и распознавания нуклеотидной последовательности с помощью нуклеазы Cas9. Однако Cas9 распознает только двухцепочечную ДНК, что ограничивает ее использование при диагностических исследованиях, требующих обнаружения РНК.

В отличие от Cas9, системы CRISPR типа III также распознают РНК. От других систем их отличает то, что при распознавании мишени происходит одновременная активация полимеразного и HD-нуклеазного доменов Cas10. Полимеразный домен генерирует около 1000 циклических олигоаденилатов на одну связанную РНК, которые, в свою очередь, активируют вспомогательные нуклеазы. Это обеспечивает усиление сигнала вместо того, чтобы полагаться только на одну нуклеазу, связанную с мишенью. Однако чувствительность методов на основе CRISPR типа III первого поколения была ограничена использованием вспомогательных нуклеаз (например, Csm6), которые разрушают циклические олигонуклеотиды.

Группа ученых из Университета штата Монтана и Мичиганского университета (США) разработала новый метод специфичной идентификации РНК-мишени в сложной смеси. Они модифицировали ранее разработанную систему на основе CRISPR типа III-A из Thermus thermophilus (TtCsm) и подобрали альтернативные вспомогательные нуклеазы. Статья была опубликована в журнале Nature Communications.

На первом этапе работы ученые провели поиск генов, кодирующих белки из семейства вспомогательных CRISPR-нуклеаз (CRISPR ancillary nucleases, Can), среди общедоступных микробных геномов и метагеномов из баз данных NCBI и JGI. Они идентифицировали 204 белка Can1 и 3121 белок Can2 и выбрали для работы Can1 из Thermus thermophilus (TtCan1) и Can2 из Archaeoglobi archaeon (AaCan2). Ученые протестировали их способность к активации с использованием библиотеки из 12 химически синтезированных циклических олигонуклеотидов, а также проверили, не разрушают ли они эти молекулы, как Csm6. Авторы показали, что обе нуклеазы TtCan1 и AaCan2 расщепляют как одноцепочечные РНК и ДНК, так и двухцепочечную ДНК в присутствии циклического олигомера из четырех аденозинов (сА4), генерируемого Cas10.

Сравнив чувствительность обнаружения РНК с использованием систем на основе нуклеаз TtCsm6, TtCan1 и AaCan2, ученые показали преимущество AaCan2, которая давала более высокий флуоресцентный сигнал при активации меньшими концентрациями сА4. Эти эксперименты также подтвердили, что у AaCan2 отсутствует активность кольцевой нуклеазы, и она не разрушает сА4 при работе.

Далее ученые модифицировали методику подготовки образцов перед анализом таким образом, чтобы не проводить этап выделения нуклеиновых кислот, а работать непосредственно с образцами от пациентов. Это позволило значительно сократить время, затраты на реагенты и оборудование. Затем они протестировали шесть лизирующих буферов, чтобы найти оптимальные условия для теста, состоящего всего из двух шагов — захвата РНК с помощью TtCsm и детекции сигнала с помощью AaCan2.

Авторы проверили чувствительность разработанного метода путем обнаружения РНК SARS-CoV-2 в двух респираторных мазках от пациентов. Чувствительность составила около 8,7 × 103 копий/мкл (15 фМ). Далее они определили специфичность метода с использованием РНК разных вирусов и не обнаружили перекрестной реактивности с РНК вируса гриппа B, респираторно-синцитиального вируса человека (RSV) и сезонного коронавируса HCoV-229E. Однако вирусы SARS-CoV-1, MERS-CoV, HCoV-HKU1 и HCoV-NL63 давали слабый сигнал. Важно отметить, что он был значительно ниже сигнала от РНК SARS-CoV-2, использованной в той же концентрации

Работа демонстрирует высокую чувствительность обнаружения РНК с помощью CRISPR-систем типа III, сравнимую с количественной ПЦР. Метод имеет такие преимущества, как более быстрое получение результатов и более низкая стоимость анализа за счет исключения этапа выделения РНК. Результаты этих исследований могут помочь приблизить использование CRISPR-dx в качестве тестов на месте оказания медицинской помощи.

Для нового коронавирусного теста на основе CRISPR-Cas13a не нужно оборудование

Источник:

Nemudraia A., et al. Sequence-specific capture and concentration of viral RNA by type III CRISPR system enhances diagnostic // Nature Communications (2022) 13, 7762, published 15 December 2022. DOI: 10.1038/s41467-022-35445-5

Добавить в избранное