ДНК-наноприманка для мультиплексной идентификации вирусов

В статистике смертей от инфекционных заболеваний во всем мире лидируют респираторные инфекции. Респираторные заболевания трудно диагностировать по симптомам, при этом подходы к терапии могут сильно различаться, поэтому необходимо развивать молекулярные методы диагностики. Во время пандемии впечатляющие результаты продемонстрировали ОТ-ПЦР и других методов амплификации. Однако проблемой остается мультиплексность, то есть возможность одновременно определять различных возбудителей в одном образце. Ученые из Великобритании создали самособирающуюся ДНК-наноприманку (DNA nanobait), способную одновременно идентифицировать несколько коротких РНК-мишеней. Для детекции используется нанопоровое зондирование.

Сначала в образец добавляют РНКазу Н и направляющие олигонуклеотиды (однонитевые молекулы ДНК длиной 20 нуклеотидов). Если в образце присутствует вирусный геном, олигонуклеотиды связываются с ним справа и слева от уникального участка-мишени. После этого РНКаза Н расщепляет гибридные участки ДНК:РНК и вырезает мишень. При выборе целевого сайта важно учитывать вторичную структуру вирусного генома, подчеркивают авторы; желательно, чтобы он находился в области с минимальным количеством спаренных оснований, иначе он останется связанным после вырезания.

ДНК-наноприманка имеет сложную структуру: от каркасной молекулы отходят «ветки», комплементарные мишеням. С «ветками» гибризизуются олигонуклеотиды, несущие метку (стрептавидин или «цветок» из шпилек ДНК); они оставляют свободным короткий однонитевой участок. Если в образце присутствует мишень, она вытесняет из дуплекса олигонуклеотид (toehold-mediated strand displacement), и с соответствующего сайта наноприманки исчезает метка.

Положение меток определяют с помощью нанопорового зондирования: отрицательно заряженная наноприманка в электрическом поле движется к положительному электроду и проходит через пору. Ток через пору резко уменьшается, когда через нее протискивается объемная метка, но если метка отсутствует — падения нет. (Принцип метода на рисунке.)

Авторы разработали наноприманку для мультиплексной идентификации SARS-CoV-2, респираторно-синцитиального вируса (универсальная для группы А), риновируса (универсальная), гриппа (универсальная для группы А) и парагриппа 1 и убедились, что эта платформа может одновременно идентифицировать несколько вирусов.

Наноприманку также можно настроить на распознавание вариантов вируса, различающихся единичными нуклеотидами. Авторы проверили это на штаммах SARS-CoV-2 (уханьский штамм, европейский штамм В.1, альфа, бета и дельта). Идентификация целей может происходить на фоне транскриптомов человека, без предварительной очистки и амплификации; тест успешно детектировал РНК SARS-CoV-2 в мазках из ротоглотки. Результаты исследования 13 образцов соответствовали результатам ПЦР-анализа

Предложенную технологию легко масштабировать и адаптировать к новым штаммам. Авторы считают, что она может стать альтернативой методам, основанным на амплификации.

Диагностическая система на основе CRISPR типа III выявляет РНК коронавируса