Фаг лямбда находит хозяина в синтетическом почвенном сообществе

Чтобы понять механизмы взаимодействия бактерий в сообществе, нужно найти способ изучать функции генов, вовлеченных в эти взаимодействия. Манипулирование активностью отдельных генов затруднено, так как существует проблема доставки генно-инженерных инструментов в конкретные виды, составляющие сообщество. Ранее команда Дженнифер Дудны разработала для этих целей систему на основе CRISPR-ассоциированных транспозаз. В новой работе ученые из Университета штата Северная Каролина предложили использовать фаги для направленной доставки редакторов оснований.

Проверку концепции провели на умеренном фаге λ, природным хозяином которого является кишечная палочка. На первом этапе ученые встроили ген зеленого флуоресцентного белка в b-регион генома фага, не содержащий жизненно важных генов. Фагом заразили культуру Escherichia coli и подтвердили встраивание в геном бактерии инженерного профага с помощью ПЦР и флуоресцентного анализа.

В качестве полезной нагрузки авторы выбрали редактор цитозина, состоящий из никазы Cas9, слитой с крысиной дезаминазой цитидина APOBEC1. Его последовательность и последовательность гидовой РНК поместили на один конструкт, который встроили в геном фага. Инженерный фаг получил обозначение λ::CBE. С помощью фага ученые успешно отредактировали мишени на хромосомной и плазмидной ДНК в культуре E. coli, а затем применили его к синтетическому почвенному бактериальному сообществу.

Сообщество состояло из трех штаммов: E. coli MG1655 и двух ризосферных бактерий, Klebsiella oxytoca M5a1 и Paraburkholderia bryophila 376MFSha3.1. Сообщество заражали фагом λ::CBE, нацеленным на оперон lacZ кишечной палочки. Редактирование превращало кодон CAG в рамке считывания в преждевременный стоп-кодон, что приводило к синтезу нефункционального белка. Сообщество высевали на селективную среду с антибиотиком. На этой среде вырастали только колонии E. coli. С помощью секвенирования по Сэнгеру и бело-голубого теста ученые подтвердили точечные мутации в lacZ, а значит, способность фага доставлять редактор основания к мишени в условиях сообщества.

На следующем этапе они сымитировали почвенное сообщество с помощью устройства EcoFAB. Оно представляет собой автоклавируемую камеру, позволяющую тестировать микробные системы в воспроизводимых условиях. Ученые заполнили камеру стерильным кварцевым песком, с помощью шприца внесли в песок бактерии, затем добавили λ::CBE и далее действовали по прежней схеме: после инкубации с фагом и бело-голубого скрининга 45 колоний E. coli проверили с помощью секвенирования по Сэнгеру. В 34 из них обнаружилась целевая мутация TAG в lacZ, в 10 колониях кодон CAG превратился в AAG и лишь в одной остался кодон дикого типа.

Полученные результаты говорят о том, что инженерные фаги способны находить хозяина в сложных условиях сообщества и редактировать его. Авторы отмечают, что успех стратегии обусловлен лизогенным циклом фага, который не приводит к гибели клетки-хозяина в отличие от литического цикла. Поэтому арсенал инструментов ограничен умеренными фагами. Тем не менее, ученые называют свою работу новой главой в доставке CRISPR-инструментов и планируют проверить новую стратегию на других почвенных бактериях.