Гиалуронан во внеклеточном матриксе обеспечивает химиорезистентность раковых клеток

Протоковая аденокарцинома поджелудочной железы (PDAC) — один из самых опасных видов рака, общая пятилетняя выживаемость при котором составляет менее 7%. Эти опухоли часто приобретают резистентность к химиотерапии. Также опухоль характеризуется фиброзным и жестким внеклеточным матриксом, и существует предположение, что свойства матрикса влияют на хеморезистентность этого вида рака. Авторы статьи в Nature Materials решили исследовать этот вопрос детально и убедились, что химиорезистентность зависит от жесткости внеклеточного матрикса и количества гиалуронана в нем.

Ученые разработали несколько вариантов искусственного внеклеточного матрикса, повторяющего характеристики естественного матрикса PDAC. Они опирались на то, что внеклеточный матрикс этой опухоли характеризуется отложением нескольких компонентов, включая фибронектин и гиалуронан. Это подтверждается результатами секвенирования РНК опухолевой и нормальной ткани, а также коррелирует с повышенной жесткостью опухоли.

Чтобы смоделировать биохимические и механические особенности внеклеточного матрикса PDAC, исследователи скомбинировали эластиноподобный белок (ELP) с гиалуронаном (HA). Полученное сочетание компонентов они обозначили как HELP.

Влияние матрикса на лекарственную чувствительность опухолевых клеток проверяли на органоидах, культивируемых в различных вариантах матрикса. После трех дней обработки гемцитабином оказалось, что органоиды, выращиваемые в жестких матрицах HELP (HELP High), характеризовались более низким уровнем маркера апоптоза — расщепленной каспазы 3, — чем органоиды, культивируемые в более мягких матриксах (HELP Low и Cultrex).

Более подробный анализ динамики возникновения проводился при длительном воздействии высокой жесткости матрикса. Органоиды культивировали в жестком (HELP High) или мягком (HELP Low) матриксе, обрабатывая их гемцитабином на разных временных промежутках. Оказалось, что со временем органоиды, выращиваемые в жестком матриксе, приобретали повышенную устойчивость к этому препарату — значение полумаксимальной ингибирующей концентрации (IC₅₀) удвоилось. Этого не происходило в мягких матриксах.

Поскольку PDAC характеризуется гетерогенностью опухолевых клеток, авторы работы предположили, что резистентность органоида может быть обусловлена отбором изначально устойчивых к лечению субклонов. Для проверки этой гипотезы они культивировали генетически баркодированные органоиды в разных вариантах матрикса, а затем проводили секвенирование в различные моменты времени. Результаты анализа опровергли это предположение — культивация в жестком матриксе не приводила к обогащению органоида субклонами, изначально устойчивыми к химиотерапии. По-видимому, клетки в органоидах изменяли свой фенотип в ответ на жесткость матрикса.

Для проверки второй гипотезы ученые проанализировали экспрессию белковых маркеров химиорезистентности. Несколько эффлюксных транспортеров лекарств из семейства ABC, обычно ассоциируемых с PDAC и/или устойчивостью к гемцитабину (ABCG2, ABCC3, ABCC4, ABCC5), экспрессировались при культивации в жестком матриксе на более высоком уровне, чем при культивации в мягком матриксе. В присутствии жесткого матрикса, как показал дальнейший анализ, в клетках органоидов был более активен транспортер ABCG2 — такие клетки интенсивнее вытесняли краситель Hoechst. При этом ингибирование транспортера с помощью Ko143 (малой молекулы с сильным сродством к ABCG2) блокировало наблюдаемый эффект.

Авторы предположили, что совместное действие гемцитабина и Ko143 повысит чувствительность органоидов к препарату и снизит выживаемость клеток. Удивительно, но они обнаружили обратный эффект — добавление Ko143 не повышало, а снижало чувствительность органоидов к гемцитабину, причем более сильный эффект наблюдался в жестких матриксах.

При этом обработка Ko143 самим по себе способствовала повышенной экспрессии менее селективных эффлюксных транспортеров на транскриптомном и протеомном уровнях. По-видимому, клетки PDAC компенсировали ингибирование ABCG2 экспрессией других эффклюксных транспортеров, что также способствовало химиорезистентности.

Модифицируя состав матрикса, исследователи проверили, какую роль в формировании химиорезистентности органоидов играют ее отдельные компоненты. Из всех протестированных вариантов на повышении уровня ABCG2 сказалась только замена гиалуронана на полиэтиленгликоль. Это указывает на то, что гиалуронановый сигналинг играет важную роль в приобретении опухолевыми клетками химиорезистентности.

Влияние гиалуронана на CD44 уже связывали с чувствительностью к лекарственным препаратам при других видах рака. В органоидах, культивированных в жестком матриксе, действительно были повышены уровни мРНК CD44. Нокаут CD44 с помощью CRISPR-Cas9 снижал экспрессию ABCG2, в том числе в жестком матриксе. Устойчивость к гемцитабину при этом не возрастала со временем.

Наконец, исследователи продемонстрировали, что изменение жесткости матрикса может влиять на чувствительность органоидов к гемцитабину. Пересадка из жесткого матрикса в мягкий и наоборот изменяла фенотип клеток органоида на противоположный — оверэкспрессия CD44 и ABCG2 в жестком матриксе оказалась обратимой, равно как и связанная с ней устойчивость к препарату.

Таким образом, механические характеристики внеклеточного матрикса играют важную роль в формировании фенотипа опухолевых клеток и их устойчивости к химиотерапии. Авторы работы предполагают, что лечение протоковой аденокарциномы поджелудочной железы механотерапевтическими препаратами, направленными на жесткость матрикса и/или его взаимодействие с клетками опухоли, может улучшить исход химиотерапии.

При раке поджелудочной железы клетки «забывают» о своем происхождении из-за MED12 и p63