Изучен транскриптом формирующегося спинного мозга человека

Спинной мозг играет центральную роль в обработке сенсорной и моторной информации и регулирует двигательное поведение за счет координированной работы моторных нейронов и других нервных и глиальных клеток, сгруппированных в пространственные домены. Повреждение или дегенерация нервной ткани спинного мозга может привести к таким расстройствам, как боковой амиотрофический склероз, спинальная мышечная атрофия или детская лейкодистрофия. В настоящее время уже получены некоторые данные о разнообразии клеток формирующейся нервной трубки человека и спинного мозга мышей. Однако развитие коры головного мозга у людей происходит более медленными темпами по сравнению с другими приматами или грызунами. С другой стороны, предполагается, что спинной мозг человека развивается и созревает быстрее, чем у грызунов. Временные особенности развития и паттерны ассоциации клеток нервной системы, характерные только для нашего вида, подчеркивают важность всестороннего профилирования развивающегося спинного мозга человека.

Группа под руководством ученых из Стэнфордского университета исследовала транскриптомику единичных клеток для описания разных типов нейронов и исследования паттернов развития эмбриональных клеток спинного мозга человека. 

Авторы работы использовали технологию Chromium от 10X Genomics, которая позволяет построить профиль экспрессии каждой клетки и охарактеризовать гетерогенность и вариабельность тысяч разных клеток в образце. Автоматические станции и реагентов серии Chromium обеспечивают точное разделение клеток, их баркодирование и подготовку библиотек для анализа на платформе Illumina. При пробоподготовке каждая клетка связывается с гелевой частицей, содержащей баркод, проходит через масляный барьер и оказывается заключенной в каплю воды, ограниченную масляной пленкой. После этого клетка лизируются, РНК связывается с баркодром, проводится обратная транскрипция. В результате образуются молекулы кДНК, принадлежность которых к той или иной клетке можно отследить по баркоду (подробнее на PCR.NEWS).

Решения 10x Genomics позволяют нейробиологам получить глубокое понимание как нормальной функции мозга, так и природы неврологических заболеваний с помощью одноклеточной и пространственной мультиомики. Получите представление о разнообразных, сложных клеточных и сигнальных путях, которые контролируют функцию ЦНС, раскройте клеточный вклад отдельных типов клеток, подтипов и состояний, участвующих в неврологическом развитии. Для подбора решений под задачи вашего эксперимента пишите в отдел научный поддержки help@skygen.com компании SkyGen – официального дистрибьютора 10Х Genomics в России и СНГ.

Исследователи проанализировали РНК единичных клеток и ядер (scRNA-seq и snRNA-seq) из четырех образцов спинного мозга эмбриона человека на 17-й и 18-й неделях беременности. Затем провели контроль качества данных, фильтрацию отдельно для клеток и ядер, а также исключили образцы с низким качеством и так называемые дублеты — случаи, когда в результате попадания двух клеток в одну липидную каплю происходит их связывание с одним и тем же штрихкодом. Дублетами считали образцы, экспрессирующие общеизвестные маркеры двух или более типов клеток. Всего ученые получили транскриптомы для 112 554 клеток и 34 884 ядер. Основные результаты транскриптомного анализа подтверждали с помощью иммуногистохимии и гибридизации in situ в криосрезах спинного мозга. 

Транскриптомы единичных клеток и ядер имели ряд отличий: в первых был выше процент рибосомных и митохондриальных генов, а для ядер было характерно более высокое отношение несплайсированной РНК к сплайсированной. Изучение дифференциальной экспрессии и анализ «Генная онтология» (GO) показали, что в ядерные транскриптомы обогащены генами, связанными с организацией синапсов (NRXN1 и SHANK1) и адгезией клеток (CDH18 и PCD9), а клеточные — генами домашнего хозяйства (GAPDH) и генами, ассоциированными с клеточным стрессом (DNAJA1 и HSPB1) и ранним ответом (FOS и JUN).

Разные линии клеток ученые сгруппировали и визуализировали с помощью алгоритма машинного обучения UMAP. Отмечено значительное разнообразие как между различными типами клеток, так и внутри типов. В белом и сером веществе были локализованы астроциты со специализированными программами транскрипции. Протоплазматические астроциты равномерно распределялись в сером веществе коры, тогда как волокнистые астроциты были организованы вдоль трактов белого вещества. Полученные данные также свидетельствуют о том, что протоплазматические астроциты приобрели свою идентичность раньше, чем волокнистые. Моторные нейроны образовали группы, напоминающие альфа- и гамма-нейроны. Таким образом, диверсификация моторных нейронов на альфа и гамма происходит на ранних стадиях развития плода, в то время как самые ранние свидетельства этой диверсификации у мышей были описаны не ранее 17-го дня эмбрионального развития (у грызунов это поздняя стадия).

Ученые объединили полученные результаты с опубликованными ранее данными о развивающемся спинном мозге человека в набор из 35 образцов, охватывающих 22 недели беременности, который содержал в общей сложности 950 215 клеток и ядер после контроля качества. Это позволило им подтвердить полученные выводы и вписать их в общий контекст развития. Объединенный набор данных представляет собой ценный ресурс для изучения биологии спинного мозга человека с течением времени. Для удобства работы с ним был создан интерактивный онлайн-браузер.

Транскриптомные исследования — одно из наиболее современных и быстро развивающихся направлений нейронауки. Одновременно с этим исследованием на странице Nature Neuroscience были опубликованы результаты работы ученых из Швеции, которые провели scRNA-seq и анализ пространственной транскриптомики (секвенирование РНК в точках на гистологическом срезе) 16 пренатальных образцов спинного мозга человека от 5 до 15 недели гестации. В дополнение к Chromium они использовали технологию Visium от 10X Genomics.

Помимо картирования генов, связанных с заболеваниями, транскриптомное картирование развивающегося спинного мозга человека открывает новые возможности для изучения клеточных основ контроля локомоции у людей. Подобные исследования играют важную роль при моделировании заболеваний на основе стволовых клеток.

В такой динамичной области экспериментальной науки главным помощником исследователей становится надежное оборудование и реагенты. Компания 10X Genomics предлагает готовые решения, которые максимально упрощают пробоподготовку для секвенирования единичных клеток. В РФ решения 10X Genomics дистрибутирует ООО «Скайджин».