Колонии синегнойной палочки прекращают рост из-за эгоистов

Ученые из США и Китая описали уникальный механизм прекращения кооперации между роящимися клетками Pseudomonas aeruginosa (синегнойной палочки). Эта бактерия известна как возбудитель внутрибольничных инфекций и легко поражает людей с ослабленным иммунитетом. Она обнаруживается в гнойных ранах, может инфицировать легкие, в том числе у лиц с муковисцидозом. В патогенезе синегнойной палочки важную роль играет так называемое роение (swarming) — особый тип поверхностной подвижности. Бактерии, посеянные на чашку Петри, распространяются в разные стороны, секретируя биосурфактанты рамнолипидной природы — «смазку», которая позволяет им скользить по агару (или по инфицированной поверхности в организме).

Хорошо известна эволюционная проблема клеточных популяций, в которых клетки выделяют вещества, полезные для популяции в целом. В то время как одни клетки тратят ресурсы на продукцию биосурфактантов, другие, находящиеся рядом с ними, могут этого не делать, но пользоваться преимуществами роения. Однако размножение таких эгоистичных клеток может привести к тому, что вся популяция утратит способность к роению. Изучение баланса между кооперацией и эгоизмом важно как с фундаментальной точки зрения, так и для поиска уязвимых мест патогенных микроорганизмов.

Авторы нового исследования выращивали клетки Pseudomonas aeruginosa PA14 на чашках с твердой средой, причем вырастали звездообразные структуры с длинными ветвями. Бактерий подвергали раундам экспериментальной эволюции: после 20 часов инкубации каждую колонию смывали с агара и около миллиона клеток пересевали в центр новой чашки. Процедуру повторяли восемь дней. В итоге в четырех независимых линиях, произошедших от одного предкового штамма, сформировались разные паттерны распределения колонии по чашке — отличались плотность «лучей» и общий размер бактериальной «звезды». Приспособленность бактерий на всех чашках, определяемая как общая биомасса колонии, к восьмому дню снижалась.

Чтобы понять, кто в этом «виноват», исследователи взяли бактерии линии 1, выросшие после пересева на седьмой день, получили из них 100 клонов и каждый вырастили на чашке отдельно. По морфологическим признакам было выделено три типа колоний. Первая группа (16%) была близка к исходному морфотипу, с длинными и тонкими ветвями. Штаммы второй группы (43%) образовывали колонии круглой или неправильной формы, покрывающие всю чашку; авторы назвали их гиперроящимися. Наконец, 41% утратил способность к роению: колонии этого типа образовывали тонкие и короткие ветви либо не образовывали их вовсе.

Полногеномное секвенирование 95 колоний разных морфотипов показало, что у всех гиперроящихся бактерий есть точечная мутация в гене fleN, который кодирует регулятор синтеза жгутика; у ее носителей появляются множественные жгутики на полюсе вместо одного. Среди 38 нероящихся бактерий 33 имели мутации в гене lasR либо в гене rsaL, продукты которых регулируют чувство кворума и участвуют в продукции биосурфактантов. У большинства бактерий, образующих колонии, сходные с колониями дикого типа, упомянутые мутации практически не встречались. Авторы подтвердили, что нероящиеся бактерии с мутациями, нарушающими чувство кворума, не продуцируют сурфактанта.

Аналогичные эволюционные эксперименты повторили в жидкой среде, не содержащей агара. В этой серии опытов темпы роста бактерий и фенотипические характеристики колоний, полученных из штаммов в конце серии пересевов, не изменились. Таким образом, именно эволюция на твердой среде с агаром приводит к снижению приспособленности популяций бактерий и изменяет их способность к роению.

Затем авторы наблюдали, как взаимодействуют роящиеся и не роящиеся штаммы, объединенные в одну колонию. Они получили флуоресцентно меченные штаммы (продукция флуоресцентных белков не повлияла на скорость роста и роения каждого из них) и инокулировали клетки-эгоисты, клетки дикого типа и гиперроящиеся клетки друг рядом с другом, так что в результате вырастали разноцветные «звезды». Таким образом они смоделировали, как могут выглядеть колонии, в которых присутствуют все возможные попарные комбинации «альтруистичных» и «эгоистичных» клеток или же клетки всех трех типов. Можно было видеть, как нероящийся штамм перемещается вместе с роящимся соседом; правда, от гиперроящихся клеток нероящиеся эгоисты все же отставали и не достигали краев колонии. Зато эгоистичные клетки распространялись быстрее клеток дикого типа, видимо, получая «нечестное преимущество» за счет большей скорости роста. Сходные результаты дало и математическое моделирование.

Хотя на твердых средах эгоистичные клетки обладали заметным преимуществом перед диким типом, это преимущество исчезало, когда их совместно высевали в жидкую среду. Как показало моделирование, выгода, которую получают бактерии-эгоисты, зависит, в частности, от распределения питательных веществ: в твердой среде оно быстрее становится неоднородным, а в хорошо перемешиваемой жидкой среде лишь плавно снижается. Роение индуцируется именно низкими концентрациями питательных веществ. Однако оно же делает популяцию уязвимой для эгоистов. В дальнейших экспериментах было показано, что доступность питательных веществ определяет, какие типы клеток будут преобладать, будет ли дикий тип вытеснен гиперроящимися клетками и смогут ли вместе с ними выжить эгоисты.

Таким образом, расширение ареала роста клеток P. aeruginosa и неравномерное распределение питательных веществ приводит как к кооперации клеток для роения, так и к подавлению кооперации и появлению клеток-эгоистов, которые потребляют ресурсы роящихся клеток. «Это явление наблюдается и в индустриальных человеческих обществах, но это риск, на который мы должны пойти, чтобы максимизировать наш рост», — говорит руководитель работы Линчон Ю из Университета Дюка.

Эволюция в пробирке помогает определить структуру белка