Корейские ученые улучшили редактор оснований для митохондриальной ДНК

В 2020 году исследователи из Института Бродов с коллабораторами разработали систему для редактирования оснований в митохондриальной ДНК. Система, получившая название DdCBEs, заменяет C на T в контексте TC-мотива без разрыва цепи ДНК. Ее главный компонент — бактериальный токсин DddA_tox, обладающий дезаминазной активностью. Чтобы избежать токсичности системы для клетки, ученые разделили DddA_tox на две нетоксичные половины и к каждой присоединили домен TALE, который можно запрограммировать на распознавание определенной нуклеотидной последовательности. К N-концу химерной молекулы TALE-DddA присоединили ингибитор урацилгликозилазы (UGI), который дополнительно увеличивает эффективность редактирования. Когда последовательность-мишень распознается доменами TALE, половины DddA взаимодействуют друг с другом и образуют функциональную цитидиндезаминазу.

Недавно было показано, что DdCBEs вносит нецелевые мутации в геномы человеческих и мышиных митохондрий и в хлоропластные геномы растительных клеток. Ученые из Южной Кореи предположили, что точность системы снижают два фактора: неспецифические взаимодействия TALE-ДНК и спонтанная сборка DddA_tox, не зависящая от активности TALE. Первый фактор определяется внешними причинами, например, выбором TALE-белка и мишени. Второй фактор представляет собой более общую проблему, поэтому ученые сосредоточились на нем. Они оптимизировали DdCBEs таким образом, чтобы предотвратить спонтанную сборку DddA_tox.

На первом этапе команда с помощью специальной компьютерной программы определила аминокислоты двух половин DddA_tox, взаимодействующие между собой при сборке токсина. Затем ученые создали серию мутантных половин DddA_tox, в которых каждая из этих аминокислот была заменена на аланин с химически инертной боковой цепью. Мутантные половины токсина комбинировали с половиной дикого типа и проверяли работу получившихся редакторов цитозина на клетках. Варианты, показавшие наибольшую эффективность, протестировали в следующих раундах эксперимента: DdCBEs закодировали на плазмиде, трансфицировали человеческие клетки и проанализировали изменения в митохондриальной ДНК с помощью высокопроизводительного секвенирования. Митохондриальную ДНК необработанных редактором клеток также проанализировали, чтобы определить и учесть в дальнейшем природные однонуклеотидные вариации. При анализе эффективности редакторов оценивались их активность и количество нецелевых мутаций в мтДНК.

Самые точные системы получили название HiFi-DdCBEs. Их целевая активность была сопоставима с таковой для DdCBEs дикого типа, а нецелевая была значительно ниже: в зависимости от мишени исходные DdCBEs вносил от десятков до сотен нежелательных мутаций, HiFi-DdCBEs же — единицы и десятки, а в некоторых случаях не было выявлено ни одного нецелевого события. Авторы отмечают, что из созданного ими набора HiFi-DdCBEs можно выбрать наиболее подходящие для конкретных исследований. Так, если специфичность важнее активности, лучше подойдет вариант с мутацией T1391A в одной из половин DddA_tox, а если предпочтительнее высокая активность, стоит использовать вариант K1389A.

По мнению авторов, в перспективе HiFi-DdCBEs будут использоваться для создания клеточных линий и животных, моделирующих заболевания.

Ранее эта же команда разработала платформу TALED для редактирования аденина в мтДНК.