Лонгрид о лонгридах: как экстрагировать длинные молекулы ДНК для секвенирования

«Многие стандартные методы (экстракции ДНК. — PCR.news), такие как колонки и магнитные частицы, не очень хороши для получения действительно больших ДНК, — говорит Келвин Лю, основатель и генеральный директор стартапа Circulomics. — То, что в итоге делает большинство пользователей, — использование очень старомодных методов», таких как очистка из агарозного геля (ДНК в геле защищена от сдвиговых сил, действующих в растворе) либо экстракция и осаждение фенол-хлороформом. Они дают чистые и длинные фрагменты ДНК, но отнимают много времени и трудно поддаются масштабированию.

В то же время потребность в высокомолекулярной ДНК растет, поскольку проекты, занимающиеся секвенированием геномов de novo, отказываются от коротких ридов: секвенирование по Illumina вытесняют методы PacBio, Oxford Nanopore, Bionano, 10x Genomics. Например, такую позицию занимает Vertebrate Genome Project (VGP), задача которого — получить референсные сборки генома для всех 66 000 известных видов позвоночных.

По словам Оливье Федриго, директора лаборатории геномики позвоночных в Рокфеллеровском университете, которая производит данные для VGP, платформа Bionano для картирования нуждается во фрагментах ДНК не короче 200 килобаз. Для секвенирования (в основном PacBio и 10x Genomics) подходят несколько более короткие фрагменты, но для тех и других задач они используют одни технологии экстракции. ДНК должна быть очень чистой, не содержать белков и других загрязнений; особенно это важно для нанопорового секвенирования.

На данный момент лаборатория Федриго использует наборы для экстракции из агарозного геля от Bionano, которые позволяют получить фрагменты свыше 250 килобаз, хорошо подходят для всех последующих применений и для различных типов образцов, включая ткани животных, кровь, клеточные линии и образцы растительных тканей. Из минусов — протокол занимает 7—10 дней, его трудно автоматизировать, что плохо совместимо с высокой пропускной способностью, необходимой для масштабного геномного проекта. Протокол Bionano пришлось модифицировать, чтобы повысить выход ДНК, сказал Федриго. Важны и методы хранения и обработки образцов; пока что наилучшим вариантом представляется замораживание.

Другие ученые стараются суммировать опыт нанопорового секвенирования ДНК различных организмов. Как отметил Джош Куик из лаборатории Ника Ломана (Бирмингемский университет, Великобритания), для бактериальных или грибковых клеток зачастую не так важен метод экстракции — проблема в том, как разрушить клеточную стенку, использовать ли ферментативный лизис или физические методы. На средства гранта Wellcome Trust Ломан и Мэтт Луз из Ноттингемского университета создали платформу Long Read Club, которая помогает исследователям обмениваться опытом по экстракции ДНК тех или иных организмов.

Для нанопорового секвенирования человеческой ДНК Куик с коллегами используют экстракцию фенолом и хлороформом, но эта трудно автоматизируемая технология едва ли позволит перейти от геномов индивидов на популяционный уровень.

Эффективность метода экстракции определяют по тому, какая часть ДНК доступна в виде больших фрагментов и по показателю N50. Этот показатель важнее, чем самое длинное прочтение.

Отдельный вопрос — как обращаться с длинными фрагментами ДНК после экстракции. Среди полезных приемов — специальные широкие наконечники для пипеток, длительное, в течение нескольких дней, «отстаивание» при комнатной температуре, чтобы длинная молекула распуталась. Интересно, что высокомолекулярную ДНК вполне возможно хранить при комнатной температуре или в холодильнике.

Удастся ли когда-нибудь получить «одним куском» ДНК целой хромосомы человека, размером в десятки мегабаз? «У нас есть несколько методов, о которых мы думаем (…), — говорит Келвин Лю. — Я думаю, что это возможно, но это будет непросто».

Далее — короткий обзор технологий экстракции высокомолекулярной ДНК, предлагаемых различными компаниями.

Bionano Genomics с момента своего создания разрабатывает методы выделения высококачественной сверхвысокомолекулярной ДНК длиной до мегабазы. Методы используют агарозный гель и непрерывно совершенствуются. В ближайшие месяцы, по словам Марка Бородкина, главного операционного директора компании, планируется выпуск новых продуктов.

Улучшение пробоподготовки начинается с протоколов сбора и хранения образцов, предотвращающих разрушение ДНК. Бионано уже сейчас предоставляет протоколы для замораживания и обработки образцов крови млекопитающих и работает над протоколами для других образцов.

Компания также инвестирует в альтернативные протоколы пробоподготовки и экстракции, без использования агарозного геля. Как отмечает Бородкин, такие протоколы отнимают меньше времени и могут быть автоматизированы. Цель состоит в том, чтобы получить очень чистую ДНК со средней длиной фрагментов не менее 250 килобаз, причем время экстракции должно быть таким же, как в протоколах экстракции для стандартных методов NGS, — несколько часов. Бородкин подчеркивает, что многих клиентов устраивают протоколы для быстрой ручной экстракции, не требующие капитального оборудования: автоматизация может понадобиться только для обработки большого количества образцов.

Circulomics — спинаут Университета Джонса Хопкинса в Балтиморе — одна из компаний, с которыми сотрудничает Bionano. В Circulomics разработана технология Nanobind: небольшие магнитные диски с наноструктурированной поверхностью из диоксида кремния, которая связывает ДНК. Как отмечает Келвин Лю, принцип тот же, что при экстракции ДНК с помощью магнитных частиц, только вместо множества частиц используется один диск, поверхность которого защищает ДНК от разрушения.

Протокол bind-wash-elute позволяет получать фрагменты ДНК длиной в сотни килобаз или даже мегабазы примерно за час. Как правило, Circulomics использует ручной протокол, но она также разработала автоматизированную версию на платформе Thermo Scientific KingFisher, которая дает возможность обрабатывать от 12 до 96 проб за полчаса.

На данный момент компания продает два набора Nanobind для экстракции ДНК, которые, возможно, будут изменены с учетом комментариев пользователей: один для крови, клеток или бактерий в культуре, другой для ядер растительных клеток. Кроме того, Circulomics оказывает услуги по экстракции ДНК из нестандартных образцов и разрабатывает коммерческий набор для выделения ДНК из ткани.

Circulomics использует два процесса — один дает фрагменты длиной до нескольких сотен килобаз, другой до мегабазы. «Когда вы получаете супербольшую ДНК, с ней, разумеется, сложнее работать, потому что она намного более вязкая и более гетерогенная. Поэтому, если вам на самом деле не нужна такая большая ДНК, лучше использовать стандартную высокомолекулярную ДНК», — сказал Лю.

Circulomics также работает над методами очистки ДНК для библиотек. По словам Лю, для этого нужны те же магнитные диски, что и для экстракции, но с другой химией, — например, чтобы избавиться от коротких фрагментов ДНК, солей или белков.

Sage Science (Беверли, Массачусетс) в 2017 году выпустила инструмент для выделения высокомолекулярной ДНК Sage HLS. Система использует электрофорез и может обрабатывать за цикл до четырех образцов (суспензии клеток, ядер или сферобластов). Процесс занимает от двух до шести часов. Интактные клетки или ядра помещаются в лунку в геле, затем в эту лунку под действием электрофоретических сил заходит лизирующий агент. ДНК освобождается от белков, РНК, компонентов мембран, которые уходят в гель. Крупные молекулы ДНК, размером в несколько мегабаз, «застревают» в агарозной сетке и остаются рядом с лункой. После этого в лунку добавляют ферменты, фрагментирующие ДНК, — неспецифические нуклеазы либо комплексы CRISPR/Cas9, которые вырезают специфические участки ДНК. Полученные фрагменты ДНК электрофорез перемещает в гель, где они разделяются по размерам, а из геля электроэлюция в перпендикулярном направлении перемещает их в шесть бункеров.

Как сообщил представитель компании Крис Боулс, Cas-опосредованный процесс, называемый CATCH, сейчас используется для выделения фрагментов размером от 50 до 400 килобаз, и компания работает над расширением диапазона размеров до 1 мегабазы. По его словам, большинство клиентов оценили приложения CATCH, в частности, для получения генов, имеющих псевдогены или сегментарные дупликации. Также с помощью SageHLS проводят подготовку ДНК для полногеномного секвенирования.

Британская RevoluGen — еще одна компания, которая работает над новыми методами экстракции ДНК с высокой молекулярной массой. Фирма разработала набор с использованием спин-колонок под названием Fire Monkey; протокол занимает около часа. Представитель RevoluGen Георгиос Патсос отметил, что набор показал хорошие результаты по сравнению с другими аналогичными наборами для экстракции. Если образец свежий, то средний размер фрагментов может превышать 100 килобаз. Как и другие методы, основанные на центрифугировании, Fire Monkey, несложно мультиплексировать — число параллельно обрабатываемых образцов, по сути, зависит от размера центрифуги.

Один из минусов технологии в том, что ДНК зачастую представляет собой сочетание коротких и очень длинных фрагментов, что мешает работе и PacBio, и Nanopore. Поэтому RevoluGen разработал протокол Fire Flower для удаления в процессе подготовки библиотеки фрагментов ДНК размером до 10 килобаз.