MabID — новый метод изучения регуляции генов

В последние годы были разработаны различные технологии для изучения механизмов регуляции генов, определяемой состояниями хроматина и эпигенетическими факторами, такими как метилирование ДНК, посттрансляционные модификации гистонов или комплексы ремоделирования хроматина. Однако до сих пор не существовало методики, позволяющей одновременно изучать несколько механизмов регуляции в одной клетке. В новой статье, опубликованной в Nature Methods, группа исследователей из Нидерландов и Японии описала методику MabID (Multiplexing Antibodies by barcode Identification).

«С помощью нашей новой методики мы можем увидеть, как связаны между собой различные механизмы экспрессии генов, например, как они работают вместе или друг против друга. И самое замечательное, что для этого нам больше не нужны отдельные эксперименты, мы можем изучать все сразу в каждой отдельной клетке», — объяснила Силке Лохс, один из руководителей исследования.

Принцип метода заключается в том, что ДНК-баркоды доставляются к участкам ДНК, на которых находятся белки мишени, с помощью антител. Собранные для исследования клетки инкубируют с первичным антителом, а затем со вторичным антителом, к которому пришит адаптер — молекула ДНК, содержащая характерную последовательность (баркод). После сортировки клеточных ядер методом проточной цитометрии геномы фрагментируют рестриктазой MseI, распознающей мотив TTAA, и дефосфорилируют, чтобы предотвратить лигирование фрагментов. Затем обрабатывают рестриктазой NdeI, которая распознает сайт в адаптере и образует липкий конец, совместимый с тем, что образуется при рестрикции MseI. В итоге адаптер можно лигировать с тем фрагментом ДНК, на котором находится белок-мишень первичного антитела. После этого проводится деградация белков и образуются фрагменты ДНК, причем баркодами помечены фрагменты, с которыми был связан тот или иной белок хроматина. Секвенирование позволит определить их положение в геноме. Благодаря адаптерам образцы можно пулировать при подготовке библиотек.

 Метод MabID. Credit: Nat Methods. 2023. DOI:  10.1038/s41592-023-02090-9 |  CC BY 4.0 DEED

Данные, полученные с помощью MAbID, в целом были сходны с результатами ChIP-seq и других известных методов. Чтобы определить разрешающую способность нового метода, авторы оценивали распределение сигнала активного хроматина (метилированный гистон H3K4me3) по сайтам начала транскрипции и сигнала репрессированного хроматина (H3K27me3) по доменам Polycomb-групп и сравнивали их с соответствующими наборами данных ChIP-seq. Сигнал H3K4me3 затухает до 50% на расстоянии 3-4 килобаз от вершины пика. Для H3K27me3 это расстояние соответствует 7-8 килобаз вокруг границы домена. Таким образом, по сравнению с ChIP-seq сигнал MAbID обычно распространяется еще на 1-2 килобазы в каждую сторону.

Для дальнейших экспериментов авторы выбрали транскрипционный фактор CTCF и SUZ12 — субъединицу репрессивного комплекса Polycomb 2. Полученные результаты подтвердили, что MAbID может профилировать не только модифицированные гистоны, но и другие хроматин-связывающие белки.

Предполагалось, что основным преимуществом метода MabID будет возможность одновременного профилирования многих эпигенетических факторов. Чтобы проверить эту возможность, авторы провели анализ MabID с четырьмя антителами разного видового происхождения к модифицированным гистонам и фосфорилированной РНК-полимеразой II и вторичными конъюгатами «антитело–ДНК-адаптер» к каждому из четырех антител. Сравнение с общедоступными данными ChIP-seq подтвердило работоспособность метода.

Авторы также оценили возможность конъюгирования адаптера с первичными антителами. Такой вариант позволил бы значительно увеличить число мишеней в одном исследовании — оно уже не будет ограничено разнообразием антител от разных видов млекопитающих, имеющихся в распоряжении экспериментатора. (Вторичное антитело, как правило, распознает первичные антитела определенного биологического вида.) С другой стороны, конъюгация может влиять на связывание эпитопа, и с каждой мишенью может связаться только одно антитело, несущее адаптер.Тем не менее удалось получить удовлетворительные результаты для шести эпитопов, охватывающих полный набор типов хроматина.

MabID также может использоваться для изучения одиночных клеток; данную разновидность метода авторы назвали scMAbID (single-cell MabID). Они дифференцировали эмбриональные стволовые клетки мыши в ранние нейрональные прогениторные клетки. Оба типа клеток инкубировали со смесью из шести первичных конъюгатов антитело-ДНК, нацеленных на различные типы хроматина. Параллельно в тех же планшетах обрабатывали клетки человека K562, чтобы сравнить результаты scMAbID с массивами данных. Соответствие оказалось несколько ниже, чем для обычного MAbID, что, вероятно, связано с меньшим количеством считываний, полученных в одноклеточных измерениях. Авторы также провели интересную серию опытов по определению аллелей на Х-хромосоме, подвергшихся инактивации в женских стволовых клетках, идентифицировали сигнатуры генной экспрессии в клетках костного мозга мыши.

«MAbID может помочь нам ответить на фундаментальные научные вопросы, например, о том, как происходит регуляция генов в процессе развития человека или животных. Но мы также можем использовать его для исследования развития заболеваний, которые могут быть вызваны нарушениями в регуляции генов, например, рака», — говорит один из участников исследования, Робин ван дер Вейде.

Эпигенетическую регуляцию при развитии 11 типов рака изучили на уровне единичных клеток