MД-2023: Борьба с фальсификацией пищевых продуктов

Анастасия Путинцева (Всероссийский государственный центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов) представила методику для выявления ДНК генно-модифицированного лосося в пищевых продуктах и кормах для животных методом ПЦР-РВ. Генетически модифицированный атлантический лосось AquAdvantage от компании AquaBounty Technologies одобрен для употребления в пищу в США и Канаде, продается в этих странах без маркировки. В его геноме присутствует ген гормона роста лосося чавычи с промотором и терминатором гена «белка-антифриза» AFP из генома американской бельдюги. У этого промотора активность не сезонная, а постоянная, поэтому рыба растет круглый год, а не только весной и летом. Обычный атлантический лосось достигает продажного размера за три года, а генно-модифицированный — за 16–18 месяцев.

В Евросоюзе AquAdvantage не одобрен, как и в России. Однако в РФ до разработки докладчицы с коллегами не существовало методик по определению ДНК AquAdvantage. между тем риск импорта существует, в том числе через третьи страны. Также белки AquAdvantage могут присутствовать в кормах для животных.

Методика основана на ПЦР-РВ, фрагмент, характерный для ГМ-лосося, определяется совместно с эндогенными внутренними контролями. Поскольку ген гормона роста в геноме AquAdvantage однокопийный, для контроля также взяли однокопийные последовательности, чтобы подобрать сходные параметры. Разработчики стремились выбрать праймеры и зонды для всех ПЦР с близкой температурой отжига и расположенные таким образом, чтобы ампликоны были близки по длине и содержанию GC. Необходимо было учитывать возможность сильной фрагментации ДНК при термообработке. Конечно, не должно быть взаимодействия с нецелевыми участками. Также тест-системы не должны быть чувствительными к ДНК человека, мыши и крысы (основные источники возможной контаминации).

Первый внутренний контроль (ультраконсервативный среди позвоночных энхансер VЕ289) подтверждает, что в образце содержится ДНК животного происхождения приемлемого для ПЦР качества. Второй внутренний контроль (видоспецифичная мишень в гене белка малой субъединицы рибосомы)— что это атлантический лосось Salmo salar. Наконец, мишень в трансгенной конструкции, кодирующей последовательности гена гормона роста GH 1, выбрана так, что зонд приходится на стык экзонов. Такой участок присутствует только в генноинженерной вставке, в природной последовательности в этом участке находится интрон и последовательности для отжига нет, поэтому положительной реакции на мясо чавычи быть не может.

Предел аналитической чувствительности теста на трансгенную конструкцию и ДНК Salmo salar — 80 копий на реакцию, аналитическая чувствительность при детекции внутреннего контроля— 150 копий. Методика была проверена на контрольной панели, включающей более 70 видов животных и растений и показала 100%-ную специфичность. Термическая обработка на результат не повлияла.

Отвечая на вопросы, докладчица сказала, что у них не имелось реальных образцов AquAdvantage, однако в данной ситуации для разработки можно было использовать кДНК гена гормона роста других лососевых рыб ввиду его высокой консервативности. На случай, если кто-то беспокоится: во время контрольных закупок признаков ГМ-лосося в российских продуктах обнаружено не было.

О методах полуколичественной оценки содержания ДНК животных в мясной продукции рассказала Ирина Солтынская (ВГНКИ). Такой подход необходим, чтобы отличить фальсификацию (продажу сосисок с курятиной под видом говяжьих) от случайно попавших в продукт примесей. Докладчица с коллегами разработали набор и калибровочные образцы, позволяющие определять в мясной продукции примеси, которых не должно там быть.

Видовая фальсификация не только снижает потребительские свойства, но и может вызвать, например, аллергию. В пищевых продуктах может оказаться зараженное мясо или мясо животного, импорт которого запрещен. Наконец, нужно считаться с моральным вредом для покупателей, которые отказываются от потребления тех или иных ингредиентов по религиозным или другим соображениям.

Для выявления фальсификации широко применяют молекулярно-генетические методики. Однако качественные тесты не могут ответить на важный вопрос: если в сосисках из говядины обнаружена ДНК курицы, идет ли речь о намеренной фальсификации или случайной примеси — условно говоря, чан для фарша помыли недостаточно хорошо? Или же мясопродукт может содержать яичный продукт, тогда присутствие куриной ДНК тоже объяснимо. Ответ на эти вопросы дают количественные или полуколичественные форматы тестирования, которые выявляют ДНК целевого животного на фоне основных компонентов.

Пока в нормативных документах РФ нет понятия «технологически неустранимой примеси» при определении сырьевого состава продукции. Но сейчас создана рабочая группа, которая обсуждает введение таких понятий и установление нормативных значений для «примесей» или «следовых количеств». До недавнего времени в РФ и стандартизованных методик не было количественного или полуколичественного определения сырьевого состава, отметила докладчица, поэтому и была поставлена такая цель.

В качестве генов-мишеней для внутреннего контроля выбрали однокопийные хромосомные последовательности — тканеспецифичные энхансеры (VE 1800), функционирующие в раннем эмбриональном развитии. Однокопийные последовательности всегда дают более четкую количественную оценку, а ультраконсервативность позволяет использовать один праймер для различных методик.

При выборе мишеней сложность состоит в том, чтобы дифференцировать целевое животное с близкими видами. Различия в геномах парнокопытных небольшие, особенно у быка домашнего и буйвола. В итоге для быка выбрали участок в гене Rpr6, рибосомального белка большой субъединицы.

ДНК лошади необходимо отличать от ДНК осла, для этого выбрали ген другого рибосомального белка S6. У осла в нем есть большая делеция, что обеспечивает высокую специфичность.

Со свиньей проще, она значительно отличается от других сельскохозяйственных животных. Для нее выбрали ген Pop1 в составе рибонуклеопротеинового комплекса, процессирующего РНК; у млекопитающих он высоковариабелен.

Методики были испытаны на различных мясопродуктах, и термически обработанных, и маринованных. На контрольной панели была показана 100%-ная специфичность. Так как для полуколичественной оценки нужна калибровочная прямая, авторы сделали стандартные калибровочные образцы на основе плазмид. Предел полуколичественной оценки составил 0,1% ДНК целевого животного.

Методики определяют содержание ДНК целевого животного относительно общей ДНК животных и птиц, позволяя отличить фальсификацию от следовых ингредиентов, и не предназначены для качественного анализа. Исследование должно проводиться только после подтверждения наличия ДНК целевого животного качественным тестом, подчеркнула Ирина Солтынская. Также они не распространяются на консервированную продукцию. Эти методики вошли в ГОСТ, который вступил в действие в декабре прошлого года. Появятся также коммерчески доступные наборы, сообщила докладчица.

О том, как методом ПЦР-РВ выявляют куриное мясо, не значащееся в составе продукта, рассказал Михаил Минаев (ФНЦ пищевых систем им. В.М. Горбатова РАН; доклад подготовлен при поддержке компании «Синтол»). Докладчик с коллегами разработали методики для идентификации мясного ингредиента кур в ГОСТированной мясной продукции и в консервах. (Для консервов требуется специальная методика, так как ДНК разрушается при длительной термообработке.) «По сути дела, мы гарантируем качество нашей ГОСТированной продукции», — сказал Михаил Минаев.

Присутствие ингредиента, о котором не сообщает производитель, плохо не потому, что курица «хуже» говядины, а потому, что происхождение такого ингредиента непрозрачно, отметил Минаев. Нигде в мире не было понимания того, что подобное тестирование необходимо, пока не произошел скандал с гамбургерами 2013 года. В нескольких европейских странах в замороженных гамбургерах оказалось мясо лошадей — возможно, ипподромных животных, которых лечили ветеринарными препаратами. Это из ряда вон выходящий случай, но и мясо кур, происхождение которого производитель не афиширует, может быть несвежим. Такие продукты представляют реальную опасность для здоровья людей.

Фальсификация продуктов мясом лошади в России экономически нецелесообразна, в отличие от курятины. При этом производитель, идущий на осознанную фальсификацию, старается обойти надзор. Например, сильное измельчение сырья делает примесь «невидимой» для гистологического анализа; в гомогенизированном фарше не различаются до 8% мяса кур. Чтобы обмануть ДНК-анализ, производители используют более жесткие режимы термообработки, якобы с целью повышения микробиологической безопасности. Все это необходимо учитывать при исследовании.

На непреднамеренное внесение примеси может указывать неоднородность образцов. Но когда примесь в одних и тех же заметных количествах присутствует в различных образцах партии или даже по всему ассортиментному перечню, тут уже не приходится говорить о случайной контаминации.

Затем докладчик подробнее рассказал о методиках и стандартных образцах. Он подчеркнул, что они разработаны не для подтверждения состава, а для выявления того, чего в составе быть не должно (поскольку методы количественные, в этом вопросе часто возникает путаница).

Встречается достаточно много проблемных образцов, содержащих примесь на пределе обнаружения, когда сложно поставить «плюс» или «минус». Разработчики предлагают для значений ΔCt около 12–14 формулировки «обнаружено на пределе чувствительности» — «не обнаружено на пределе чувствительности», с тем, чтобы не было недоумений, если в нескольких повторностях будет получаться то отрицательный, то положительный результат.

Михаил Минаев рассказал о том, как вопросы регулирования состава мясной продукции обсуждаются в рабочей группе Евразийской экономической комиссии. В частности, специалисты ФНЦ пищевых систем им. В.М. Горбатова предложили ввести в нормативные документы термины «технологическая примесь» и «следовое количество» и определить ассортиментный перечень продукции, подлежащей нормированию. Также обсуждается маркировка продуктов, содержащих примеси в том или ином количестве.

Информация о докладчиках

Путинцева Анастасия Владимировна. ФГБУ «Всероссийский государственный центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов» («ВГНКИ»), научный сотрудник отдела молекулярной биологии 

Солтынская Ирина Владимировна, ФГБУ «Всероссийский государственный центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов» («ВГНКИ»), заведующая отделом молекулярной биологии

Минаев Михаил Юрьевич, ФГБНУ «ФНЦ пищевых систем им. В.М. Горбатова» РАН, заведующий лабораторией молекулярной биологии и биоинформатики