МД-2023. Oxford Nanopore быстро определяет неизвестные патогены в клиническом материале

К.б.н., в.н.с. Анна Сперанская, заведующая лабораторией мультиомиксных исследований НИИ системной биологии и медицины Роспотребнадзора (НИИ СБМ), поделилась практическим опытом идентификации неизвестных патогенов в клиническом материале. В своей практике она и ее коллеги используют технологию Oxford Nanopore, причем главным преимуществом для них является не длина прочтений, а высокая скорость работы.

Научно-исследовательский институт системной биологии и медицины был создан совсем недавно, в марте 2022 года, а закупка оборудования происходила в конце 2021 года. В лаборатории мультиомиксных исследований, которой руководит Анна Сергеевна, есть не только секвенаторы, но и олигосинтезаторы, а также оборудование для протеомного анализа. Среди секвенаторов есть приборы от разных производителей, например, DNBSEQ-G400 (MGI, Китай), но в докладе речь шла о моделях производства Oxford Nanopore Technologies (Великобритания) — в частности, о нанопоровом секвенаторе PromethION (24 x 3000 каналов).

Обычно специалисты выделяют у этой платформы такое преимущество, как низкая стоимость секвенирования, но для России это не так. Вторым достоинством считается простая и быстрая подготовка материала перед секвенированием. И конечно, это прибор для высокопроизводительного секвенирования.

Анна Сергеевна с этим не согласна, так как требуется разнообразное дополнительное оборудование, расходные материалы, наборы для выделения нуклеиновых кислот — чем в лаборатории их больше, тем более обширный спектр задач можно решить. Также Анна Сергеевна выразила сомнение в том, что с этим секвенатором можно работать в полевых условиях, ведь реагенты должны храниться в холодильнике, а на месте необходимы дополнительные приборы, которые позволят оценить качество материала и библиотеки перед началом анализа. Недостаток технологии Oxford Nanopore —количество ошибок. Если стандартным качеством секвенирования на платформе Illumina или китайских приборах считается Q30, то при секвенировании патогенов с помощью ONT, например SARS-CoV-2, производитель рекомендует выставлять качество Q7.

Тем не менее Анна Сергеевна убедила слушателей в том, что прибор от ONT стоит использовать для диагностических целей в сложных случаях — если речь идет об инфекционных заболеваниях и в случаях возникновения эпидемии. Он служит для своевременного выявления новых генетических вариантов патогенов, например, если люди прилетели из тропической страны и у них обнаружили высокую температуру. Их могут снять с самолета, изолировать и отправить материал на исследование, а в этом случае важно побыстрее получить результат. Технология Oxford Nanopore помогает в исследовании нестандартных случаев, например, двойных инфекций, а также в реконструкции путей передачи инфекции, что бывает важно как для принятия управленческих решений, так и для создания прогностических моделей распространения патогенов.

Какие могут быть подходы при анализе материала? Во-первых, можно тотально секвенировать все имеющиеся в материале нуклеиновые кислоты. Во-вторых, можно прицельно прочитать только геном патогена, но перед этим нужно обогатить образец одним из известных способов. В-третьих, можно провести фрагментное секвенирование, чтобы определить ключевые мутации и установить, относится наш патоген к эпидемически значимым или нет.

Таргетный метагеномный анализ производится на основе ДНК-штрихкодов, например, ITS для идентификации грибов, 16S рРНК — для бактерий. Их можно секвенировать по отдельности короткими участками, а можно – длинную молекулу целиком. При этом, чем длиннее молекулу мы получим, тем точнее сможем определить таксономическое положение патогена.

Но есть одна особенность: лаборатории, которые работают с материалом от инфицированных, обычно получают образцы с низкой концентрацией ДНК патогена, да еще и плохого качества, часто бывают нарушены условия хранения и транспортировки. За те несколько дней, в течение которых врач осознает необходимость прицельного анализа, у пациента падает вирусная нагрузка. Кроме того, в клиниках, где осуществляют забор материала, обычно нет подходящей для хранения образцов реагентики. Поэтому, в действительности у специалистов НИИ СБМ нет возможности прочитать длинные фрагменты ДНК-штрихкодов патогенов, которые позволили бы точно установить таксономическую принадлежность.

Казалось бы, в таком случае нужно использовать приборы, осуществляющие короткие прочтения, но Анна Сергеевна и ее коллеги предпочитают работать на платформе ONT. Как правило, все экстраординарные случаи или единичные, или представлены 10–20 образцами, при этом ответ нужно дать очень быстро. Все высокоточные и высокопроизводительные секвенаторы дают очень много информации, что нерационально для запуска одного образца, а кроме этого, они работают слишком долго. Технология Oxford Nanopore позволяет в любой момент остановить сиквенс и оценить результаты, а затем решить, продолжить или прекратить его, чтобы сохранить остаток мощности ячейки для других исследований.

В качестве примера Анна Сергеевна привела исследование аутопсийных образцов от двух погибших детей из другого города, а также от лиц, контактировавших с ними. У всех была метапневмовирусная инфекция, подтвержденная РТ-ПЦР. Случаи смерти детей от инфекционных заболеваний должны быть тщательно исследованы, поэтому первое, что сделали специалисты НИИ СБМ, — поставили РТ-ПЦР на все патогены, для которых имели возможность это сделать. Обнаружили, что у части пациентов помимо метапневмовируса присутствовали и другие возбудители (у обоих умерших — S. pyogenes). Одновременно с постановкой РТ-ПЦР производили пробоподготовку для запуска Oxford Nanopore, амплифицировали короткие фрагменты, и через 1,5 суток анализ был запущен на приборе PromethION. Результаты подтвердили, что в аутопсийных образцах присутствовали последовательности S. pyogenes в большом количестве.

Самое сложное — корректно интерпретировать результаты секвенирования. Следующий пример представляет собой как раз такой случай: специалисты что-то нашли, но интерпретировать не смогли. Они получили аутопсийный материал от умершей пациентки с диагнозом «фульминантный гепатит» и провели поиск возможного возбудителя. Ничего не обнаружили с помощью РТ-ПЦР, ДНК-штрихкоды бактерий амплифицировать также не смогли, зато удалось амплифицировать ДНК-штрихкоды грибов. В результате анализа был в значительном количестве обнаружен гриб Rhodotorula mucilaginosa — вид условно-патогенных дрожжей, которые могут вызывать эндокардит, менингит, перитонит и другие инфекции. Он был также обнаружен в крови близких родственников умершей. Однако до конца не ясно, мог ли этот гриб стать причиной смерти.

Для определения полных последовательностей геномов используют разные стратегии обогащения материала, но чаще всего амплификацию. Если в лабораторию приходит материал плохого качества, то необходимо наработать большое число коротких ампликонов, а для этого нужно синтезировать много праймеров.

Так, в НИИ СБМ на исследование прислали материал от больного ветрянкой, попросили генотипировать патоген. В качестве образца прислали прозрачную жидкость, в которой вирус выявлялся в очень низкой концентрации (Сt 29–31). Имея в лаборатории олигосинтезаторы, специалисты провели неспецифическую полногеномную амплификацию (WGA), одновременно с этим синтезировали панель из 46 пар праймеров, позволяющих амплифицировать фрагменты генома длиной 3000 п.о. Провели секвенирование на PromethION. В результате покрыли примерно 20% от референсного генома и определили 7 из 23 дифференцирующих мутаций, которые используются для генотипирования вируса VZV. Вся работа, включающая проведение полногеномой амплификации, подбор праймеров, условий амплификации, поиск референсных образцов для положительных контролей, заняла 3–4 недели.

Для сравнения Анна Сергеевна привела вирус SARS-CoV-2, который в последние годы исследует весь мир. В отличие от всех приведенных ранее примеров, для секвенирования генома коронавируса существуют стандартные способы пробоподготовки и готовые решения от производителей с простыми протоколами. В этом случае один день занимает пробоподготовка и еще от 4 до 72 часов, в зависимости от прибора — само секвенирование. После этого, используя полностью готовое программное обеспечение можно быстро собрать геном и проанализировать его. Более того, этот подход может быть автоматизирован. За период с февраля 2022 года по ноябрь 2023 года специалисты НИИ СБМ в фоновом режиме секвенировали более 20000 геномов коронавируса.

Анна Сергеевна подчеркнула необходимость разработки полностью готовых решений для самых распространенных патогенов — нужны не просто наборов реагентов для подготовки библиотеки, но и биоинформатические алгоритмы для обработки полученных данных и способы интерпретации результата.

Зачем специалисты секвенировали геномы SARS-CoV-2? Во-первых, для расшифровки вспышек, например, среди иностранных студентов, приехавших после каникул. Благодаря полностью готовому решению за считанные дни специалисты дали ответ: это не какой-то новый опасный геновариант штамма, студенты больны как минимум тремя разными вариантами. Во-вторых, геномы коронавируса нужны для долгосрочных исследований циркуляции вируса на территории России. Так, вариант Омикрон ВА.1 пришел в Россию примерно на три-четыре недели позже, чем распространился по Европе, как и вариант ВА.2. При этом для Москвы показана аналогичная странам Европы динамика циркуляции.

В заключение доклада Анна Сергеевна сообщила хорошие новости: Роспотребнадзор поставил задачу внедрить секвенирование не только в центральные институты в столице, но и в Центры гигиены и эпидемиологии в регионах. На это было выделено финансирование, и уже полтора года на местах проводится обучение специалистов методам автоматизации лабораторных процессов, пробоподготовке перед нанопоровым секвенированием, управлению секвенаторми GridION и MinION, а также навыкам анализа данных. Специалисты из 18 центров уже закончили обучение. Оно происходит при непосредственном участии компании «СкайДжин», при этом технические специалисты обеспечивают непрерывную поддержку пользователей из разных часовых поясов.