МД-2023: Решения для полноэкзомного секвенирования от китайских производителей Nanodigmbio и Vazyme не уступают традиционным

erid:LdtCKK8SZ

Сотрудник группы методов высокопроизводительного секвенирования Центра высокоточного редактирования и генетических технологий для биомедицины Вера Белова сравнила существующие решения для полноэкзомного секвенирования от новых для РФ производителей с теми, к которым привыкли отечественные специалисты. По результатам сравнения получается, что новые китайские решения от Vazyme и Nanodigmbio не уступают Agilent, а в некоторых аспектах даже превосходят его.

Лаборатория, где работает Вера Александровна, основана в 2019 году на базе ФГАОУ ВО РНИМУ им. Н.И. Пирогова и фокусируется на анализе экзома человека — выявлении наследственных заболеваний у больных и носительства патогенных вариантов у здоровых. К настоящему времени изучено уже более 6000 образцов. Это референсная лаборатория технологии MGI в России, где сотрудники проводят полный цикл исследований — пробоподготовку, секвенирование, биоинформатический анализ и интерпретацию результатов. Кроме исследования экзомов человека, проводились и работы по секвенированию геномов бактерий, SARS-CoV-2, древней ДНК.

Секвенирование экзома (WES) — это секвенирование всех белок-кодирующих генов (около 1% от генома). Экзом является наиболее исследованной частью генома человека (85% связанных с генетическими заболеваниями вариантов). WES имеет ряд преимуществ перед полногеномным секвенированием (WGS), при этом его клиническая значимость по литературным данным незначительно ниже (2–6%). А стоимость исследования гораздо меньше, так как нужно получать меньше данных (8 GB для WES и 90 GB для WGS). Среди ограничений — чувствительность к инделам и структурным перестройкам.

Чтобы подготовить экзом для анализа нужно сначала выделить геномную ДНК, фрагментировать, подготовить стандартную шотган-библиотеку. Затем — загибридизовать библиотеки с разработанными различными зарубежными производителями зондами, комплементарными экзому, и произвести захват этих зондов с помощью биотин-стрептавидиновых взаимодействий магнитными шариками. Далее идут этапы чистки, ПЦР, секвенирования и обработки данных.

Как правило, все коммерческие наборы отличаются размером таргета, который определяется дизайном зондов. Классическими для российского рынка являются западные производители (Agilent, Roche, Twist, Illumina), которые исследователи широко использовали до 2022 года. В условиях санкций и долгих периодов ожидания поставки многие в настоящее время присматриваются к китайским решениям, например, от Vazyme и Nanodigmbio.

Для проведения WES на приборе DNBSEQ G-400 (MGI, Китай) специалисты Геномного центра ранее адаптировали протокол для обогащения с использованием Agilent SureSelect v6, сравнили с оригинальным протоколом от MGI и работали с ним все последующие четыре года, заменяя версии реагентов, когда появились Agilent SureSelect v7 и Agilent SureSelect v8.

При сравнении реагентов от Agilent с китайскими решениями в первую очередь специалистов интересовал размер таргета. Он составил 35,24 Mb (Agilent v8), 34,93 Mb (Vazyme) и 34,93 Mb (Nanodigmbio). На диаграмме Венна размер таргета от китайских производителей сильно пересекался с Agilent. Если посмотреть в IGV (Integrative Genomics Viewer), то регионы BED файлов, полученных с использованием Vazyme и Nanodigmbio, в основном совпадают с Agilent.

Далее исследователи попарно обогащали одни и те же библиотеки зондами Agilent v8 против Nanodigmbio и зондами Agilent v8 против Vazyme. Библиотеки пулировали до обогащения — в каждом экзомном пуле было 12 библиотек. После обогащения секвенировали на DNBSEQ G-400 в режиме парноконцевых прочтений (PE100), один пул обогащенных экзомов — на одну дорожку ячейки секвенатора. После получения данных для корректного сравнения провели downsampling до минимального образца в пуле — 44 миллиона прочтений. В результате такого эксперимента получились следующие данные по составу: on-target риды 83,46% (Agilent v8), 85,49% (Vazyme) и 84,69% (Nanodigmbio) — хорошие результаты для всех трех систем. По количеству дупликатов наилучший результат обогащения показал Vazyme — всего 3,83%. Для Nanodigmbio процент дупликатов был несколько выше — 7,69%.

Далее специалисты сравнили среднее и медианное покрытие таргета. При одинаковом количестве ридов (44М ридов/экзом) они получили медианное покрытие немного выше среднего. В целом это хороший показатель, который говорит о том, что потенциально и меньшее количество данных на образец позволит получить сравнимое покрытие. Vazyme и Nanodigmbio показали себя чуть лучше, чем Agilent v8. Исследователи посмотрели на равномерность покрытия, которую хорошо отражает характеристика Fold 80 — при абсолютно равномерном покрытии этот показатель будет равен 1, а если между регионами таргета есть разброс по покрытию, то он будет больше 1. Для экзома равномерность покрытия никогда не бывает равна единице из-за этапа гибридизации. Но стоит подчеркнуть, что благодаря усовершенствованной пробоподготовке, приводящей к качественным прочтениям и равномерному покрытию, процент покрытия целевых участков экзома превушает 96%.

Для пары Agilent v8 и Nanodigmbio не было статистически значимой разницы в покрытии, а для Agilent v8 и Vazyme — небольшие, но значимые отличия в лучшую сторону у Vazyme.

Больше всего специалистов Геномного центра интересовал такой показатель, как полнота — доля таргета, покрытая не менее X раз, один из ключевых критериев для экзома. Доля таргета, покрытая не менее 10 раз, должна превышать 95%. При одинаковом количестве ридов на экзом полнота была больше для Vazyme и Nanodigmbio – полнота 10х для них составила около 98%, 20х – около 97 %, 30х – около 92%, 50х – около 70 %.

Вера Александровна подвела итог: по результатам предварительного сравнения получается, что новые китайские решения от Vazyme и Nanodigmbio не уступают Agilent v8, а в некоторых аспектах - даже превосходят: покрытие большего процента таргетных регионов для них выше. Равномерность покрытия сопоставима с Agilent v8. Таким образом китайские бренды являются доступными аналогами для российских ученых.

Симпозиум завершился на приятной ноте — розыгрышем памятных подарков от «СкайДжин». Участники получили сувениры — кружки, блокноты и даже светильники, специально для тех, кто иногда задерживается на работе допоздна. Победитель розыгрыша забрал с собой главный приз — набор для выделения нуклеиновых кислот.

Реклама. Рекламодатель ООО"СКАЙДЖИН". ИНН: 7705997147