Модифицированная тРНК обходит преждевременный стоп-кодон, вызывающий муковисцидоз

Муковисцидоз — наследственное заболевание, поражающее железы внешней секреции (в первую очередь страдают дыхательная система и кишечник). Он вызывается мутациями в гене CFTR, в том числе нонсенс-мутациями — преждевременными стоп-кодонами, которые нарушают синтез полноразмерного белка. Авторы статьи в Science создали терапевтическую платформу, основанную на невирусной доставке супрессорных РНК, восстанавливающих экспрессию, и показали на мышах и органоидах, что она эффективна против муковисцидоза с нонсенс-мутациями в CFTR. 

Супрессорные тРНК могут обходить преждевременные стоп-кодоны и обеспечивать экспрессию нормального белка, несмотря на нонсенс-мутацию. Но они не лишены проблем, которые ограничивают их терапевтическое применение, — иммуногенность, невысокая целевая активность и трудности доставки. Исследователи предположили, что введение определенных модификаций в супрессорные тРНК поможет решить эти проблемы, поскольку эндогенные тРНК и так подвергаются масштабным модификациям, которые влияют на их сворачивание, стабильность и функциональность. 

Влияние химических модификаций проверяли на супрессорной глицил-тРНК. Для этого ученые синтезировали различные варианты с модификациями в различных участках — D-петле, T-петле, антикодоновой петле и акцепторном стебле. По результатам скрининга на клеточной модели (линия легочного эпителия BEAS-2B с репортерной нанолюциферазой) наиболее перспективной модификацией оказался 1-метиладенозин в 58-й или, при отсутствии там аденина, 57-й позиции (m¹A58 и m¹A57 соответственно). Эта модификация повышала эффективность аминоацилирования тРНК и ее стабильность — рассчитанный период полураспада составил 29 дней против 12 у немодифицированной тРНК. Сама модификация также была стабильной. 

Помимо оптимизации самой терапевтической РНК важно обеспечить ее доставку. Исследователи воспользовались липидными наночастицами, адаптированными к доставке супрессорных тРНК. Ключевой компонент, который определяет биосовместимость и эффективность доставки, — это ионизируемые липиды. Авторы провели скрининг библиотеки из тысячи структурно различных молекул, чтобы подобрать наиболее подходящие липиды и оптимизировать состав самих липидных наночастиц для доставки тРНК в клетки легких. Полученный вариант был совместим с аэрозольным распылением, то есть позволял вводить препарат в легкие с помощью ингаляций. 

Затем ученые перешли к проверке терапевтического применения своей платформы. В качестве модели заболевания они выбрали муковисцидоз, поскольку нонсенс-мутации в CFTR до сих пор представляют нерешенную клиническую проблему. Супрессорной аргинил-тРНК обработали клеточную линию с мутацией R1162X, то есть с заменой аргинина на стоп-кодон в 1162-м положении. Такая обработка восстановила экспрессию полноразмерного CFTR.

Безопасность полученных липидных наночастиц с тРНК оценили на мышах, которым вводили различные дозы препарата в трахею. Анализ цитокинов в бронхоальвеолярной жидкости показал, что в первый день у мышей, получавших 5 и 10 мг/кг, развивалась кратковременная воспалительная реакция, однако уровни цитокинов нормализовались к 14-му дню. При меньшей дозировке — 1 и 3 мг/кг — отклонение от контрольной группы было незначительным. Аналогичная динамика цитокинов наблюдалась и в сыворотке крови. 

Терапевтическую эффективность ученые проверили на мышиной модели муковисцидоза (с мутацией R553X в CFTR. Животные получали три дозы липидных наночастиц с супрессорной аргинил-тРНК, а через два дня после третьей дозы у них брали на анализ образцы легочной ткани. Терапия повысила уровни мРНК CFTR и была эффективнее, чем немодифицированная тРНК или липидные наночастицы стандартного состава. Однако явные патологии легких в мышиных моделях муковисцидоза отсутствуют, поэтому авторы провели опыты еще и на кишечных органоидах с такой мутацией. Набухание, индуцированное форсколином, усилилось при обработке терапевтическими частицами — это признак того, что функциональная активность CFTR возросла. Эффект наблюдался и на органоидах из клеток пациента с муковисцидозом, которые обрабатывали супрессорной тРНК и препаратом Трикафта, модулирующим работу CFTR. 

Таким образом, модифицированная супрессорная тРНК, доставляемая в составе липидных наночастиц, позволяет восстановить синтез белка, несмотря на наличие нонсенс-мутации в его гене, — это подтвердили на примере CFTR. Кроме того, липидные наночастицы в этой системе совместимы с доставкой в легкие в виде аэрозоля, то есть подходят для ингаляций. Авторы рассчитывают, что разработанная ими платформа найдет применение в терапии муковисцидоза. 

Редактор оснований исправляет мутацию при неизлечимой форме муковисцидоза