Найден новый вид бактериофага группы T5

Бактериофаги группы Т5 — классический объект молекулярной биологии; они инфицируют другой классический объект биологии, кишечную палочку. Фаги группы Т5 распознают бактериальные О-антигены липополисахаридной природы с помощью боковых хвостовых фибрилл. Считается, что после этого рецептор RBP (pb5) на центральной хвостовой фибрилле может взаимодействовать с белком на поверхности кишечной палочки (конечным рецептором фага), что в итоге приводит к эжекции фаговой ДНК в клетку. Кстати, конечный рецептор в данном случае — тот самый белок FhuA, который используют для изучения белок-белковых взаимодействий.

Новый бактериофаг был обнаружен российскими учеными ( ФИЦ «Фундаментальные основы биотехнологии», МФТИ, ФНКЦ физико-химической медицины, НЦ психического здоровья, МГУ им. М.В. Ломоносова). Его выделили из конских экскрементов вместе с бактериофагом 9g. Обработанная первичным лизатом культура E.coli, резистентная к фагу 9g, давала положительный ПЦР-сигнал по главному гену капсида T5, однако при использовании 9g-специфичных праймеров сигнала не давала. Отсутствовал сигнал и в ПЦР очищенного фага 9g. Это означало, что в первичном лизате присутствует еще один Т5-фаг, названный Gostya9.

С помощью электронной микроскопии была получена структура Gostya9 — типичная для T5-фагов, однако без боковых хвостовых фибрилл. Визуализировать их так и не удалось, как не удалось и подобрать синтезирующий О-антигены штамм E.coli дикого типа, чувствительный к Gostya9. Вероятно, боковые фибриллы фага Gostya9 либо не распознают О-антиген, либо отсутствуют, либо функционируют неправильно.

Выравнивание генома фага дало лучший результат — всего 79,6% идентичности (для фага DT57C), что ниже, чем принятый порог сходства геномов фагов внутри одного вида — 95%. Однако отличия в основном объяснялись вставками или делециями, и между выравненными фрагментами процент сходства был намного выше: 95–100%.

Большинство приобретенных или утерянных фагом Gostya9 открытых рамок считывания кодируют либо предполагаемые белки, либо эндонуклеазы. Также различается число тРНК: 15 генов тРНК у DT57C и 12 — у Gostya9.

Вот наиболее важные отличия белков и генов Gostya9.

— ДНК-полимераза имеет дополнительный необычный домен, очень отдаленно напоминающий RecA-белки бактерий (сходство аминокислотных последовательностей 28%);

— ген хвостовых фибрилл — один, в то время как у DT57C два более коротких;

— отсутствует ген llp, который экспрессируется в латентный период и блокирует конечные рецепторы фага, предотвращая суперинфекцию;

— рецептор RBP (pb5) сильно отличается от таковых у фагов Т5, DT57C и BF23, для которых известны конечные рецепторы.

Продукт отсутствующего у Gostya9 гена llp, как и белок pd5, взаимодействует с конечным рецептором фага. Поэтому отличия в них, вероятно, свидетельствуют о необычной рецепторной специфичности фага Gostya9. Так как на данный момент известно всего три конечных рецептора Т5 колифагов (FhuA для фага T5, FepA для фага H8 и BtuB — для DT57C и BF23), открытие еще одного, вполне возможно, поспособствует использованию этих фагов в терапевтических целях.

PCR.news задал несколько вопросов ведущему автору работы, доктору биологических наук, заведующему лабораторией вирусов микроорганизмов в ФИЦ «Фундаментальные основы биотехнологии» РАН Андрею Летарову.

Почему вы искали фагов в таком неочевидном месте?

По-моему, место самое очевидное: искали колифагов. Коли в лошадях живут, при этом сообщество их толстого кишечника — это практически хемостат. Хорошо себя там чувствуют именно вирулентные колифаги — в отличие от людей, где они по большей части умеренные. Там переваривается целлюлоза, поэтому активность микробов довольно высокая не только на стенках. Процесс этот медленный, часа так 72, а лошади едят и какают значительно чаще, то есть никакой цикличности тоже нет, неважно, давно скотинка обедала или недавно. Мы, собственно, начинали это как проект по экологии и эволюции. В таком ключе и работаем. Но с разнообразием колифагов у них очень хорошо, поэтому для прикладных задач — туда же.

Ну и возиться с таким объектом куда приятнее: кал не имеет мерзостного запаха, на лошадях можно кататься. Если нужно получить тотальное сообщество с разверткой по времени, тоже никаких проблем, хоть килограмм собирай в каждой точке.

Следующий вопрос про таксономию фагов. Сейчас к одному виду относят как раз по генетическому сходству? И для каждого таксона есть свой порог?

Это больная тема. Формально да, для видов 5%, для родов 30% различий, но с видами это почти механически, роды стараются все-таки выделять с применением головы. На самом деле для низших таксонов это плохой критерий. Там может 20% давать минимальные видимые фенотипические различия, а может 2% весьма серьезно различать вирусы. Но сейчас их выделяют весьма активно, и часто кроме генома ничего нет. Да и специалистов на каждую группу не напасешься.

Насколько среди фагов распространен способ предотвращения суперинфекции, описанный в статье, — блок конечных рецепторов? То есть что более вероятно: что у найденного фага вообще нет системы, предотвращающей суперинфекцию, или что она какая-то другая?

У Т5-подобных блок обычно есть. У других далеко не всегда, умеренные часто так защищают лизоген.

Видимо, нет вообще, но толком это никто не проверял. Эти гены сложно предсказать. Если меняется рецептор, меняется и ген. У Т5 и его родственников они образуют модуль, то есть находятся рядом с RBP, и тогда можно угадать, что эта маленькая штуковина рядом с pb5 и есть llp. И проверить соответственно. Но поскольку Gostya9 — это почти в точности DT57C, у которого llp был на месте, то наиболее вероятно, что у Гостьи он потерялся при приобретении новой версии pb5.

Как вообще проверить, способен ли фаг предотвращать суперинфекцию? Только по наличию гена?

Ну, если на уровне адсорбции, то можно заразить клетки фагом А, а потом добавить к ним фага B, похожего на А, но у которого есть другой хозяин, на котором его можно оттитровать дифференциально. Мы так не делали, ибо ген мы угадали (когда работали с DT57C), и тогда мы его просто заклонировали и посмотрели, как фаг себя чувствует на этих клетках.

А почему Gostya9?

Гостья — это кобыла в Нескучном саду. ICTV (International Committee on Taxonomy of Viruses. — PCR.news.) активно просит перестать называть вирусы в стиле P38K24bR5. Это я, конечно, из головы придумал, но даже 9g — кошмар. Очень велика вероятность совпадения. Они призывают использовать слова. Corndog, BcepNazgul — это реальные фаги.

Вопрос про фаготерапию: почему ее все еще редко применяют?

На это много причин. Во-первых, применять ее сложно. Во-вторых, у нас много лет ей толком никто не занимался. Было производство, была практика, а исследований настоящих не было. На Западе и того хуже.

Теперь же наткнулись на регуляторные запреты. Чтобы это официально продать как лекарство, нужно испытать конкретную композицию с кучей требований. И если ты хочешь ее поменять, то все по новой. Это с идеологией ФТ просто несовместимо: используемая ФТ  противопоставляет эволюции патогена естественную эволюцию фагов. Следовательно, она успешна только при активном и динамичном использовании их биоразнообразия. Плюс ко всему есть естественные ограничения: фаги в природе вовсе не настроены на полное уничтожение бактерий, им скорее нужно с ними сосуществовать. Поэтому взаимодействия имеют слишком много гитик. А еще есть фармакокинетика. Они же большие, чуть не с бактерию размером.

Я когда-то видела древний репортаж про ФТ в Тбилиси. Там институт фагов, поэтому ФТ развита прямо до того, что идешь в поликлинику, а тебе, условно говоря, в нос фага капают. Не знаете, там все так и есть или это враки?

Точно, капают. Институт есть, но наука в нем так себе, в основном эмпирика. Но в Грузии действительно с формальностями проще, ФТ у них национальная гордость.