Новые белки Cas9 повышают эффективность генного драйва у насекомых

В настоящее время CRISPR-Cas система находит все больше применений. Например, ее используют для активации генного драйва, направленного на изменение вероятности, с которой участок ДНК будет передан потомству. В этом случае эндонуклеаза Cas9 делает двуцепочечный разрыв в целевом участке, а клетка чинит эту поломку с помощью гомологичной рекомбинации. В результате, вероятность передачи потомству варианта с хромосомы-донора увеличивается. Генетический драйв можно использовать в экологии для элиминирования патогенных свойств вида.

Для манипуляций с более маленькими участками (например, аллелями одного гена) был разработан аллельный драйв. В данном методе направляющая РНК конструируется таким образом, что аллель с донорской хромосомы не может быть разрезан нуклеазой. В итоге, разрыв происходит только в чувствительном аллеле, а информация копируется с устойчивого варианта.

Ученые из Калифорнийского университета (Сан-Диего, США) протестировали мутантные нуклеазы Cas9, которые вносят одноцепочечные разрывы, и сравнили их с белком дикого типа. Также они оценили вклад негомологичной репарации концов, которая может иногда происходить вместо гомологичной рекомбинации с хромосомы-донора.

Для оценки аллельного драйва ученые использовали локус дрозофилы white (w), расположенный на X-хромосоме. Они сконструировали несколько чувствительных и резистентных к нуклеазе аллелей. Оба типа аллелей приводили к белому цвету глаз. В чувствительных аллелях это происходило из-за 12-нуклеотидной делеции (без сдвига рамки считывания, СS1^-) или однонуклеотидной вставки (со сдвигом рамки считывания, СS2^-) в самом гене, а в резистентных — из-за отсутствия стартового кодона. Стоит отметить, что резистентных аллелей-доноров также было два: один содержал функционирующий вариант гена (CR⁺), другой — сломанный вариант (CR^-).

После скрещивания мух CS1^- или CS2^- c мухами CR⁺ у женского потомства развивалась красная окраска глаз за счет гомологичной рекомбинации. В мужском потомстве у Х-хромосомы нет гомологичной пары, поэтому репарация может происходить только путем соединения негомологичных концов. Тем не менее, и в мужском потомстве появлялись красные глаза. Это происходило только в случае аллеля CS2^-, так как однонуклеотидная вставка могла быть случайно исправлена в процессе репарации. Тот же результат ученые получали в женском потомстве пары CS2^-/CR^-, в котором восстановление функции также могло произойти с помощью соединения негомологичных концов. Таким образом, благодаря фенотипическому анализу дрозофил ученые могли оценить эффективность распространения аллеля и вклад различных механизмов репарации в этот процесс.

Затем исследователи сравнили конверсию аллеля в зависимости от типа эндонуклеазы. Для эксперимента они выбрали три фермента: Cas9 дикого типа, который делает двухнитевой разрыв, и две его мутантные формы D10A и H840A (никазы), которые вносят однонитевые разрывы. Все три фермента успешно способствовали аллельной конверсии. В условии одинаковых генных кассет никазы показали наибольшую эффективность распространения аллеля. Для H840А она составляла 61%, для D10A — 45%, а для Cas9 — 20%. Также никазы показали хороший результат в распространении аллелей, когда оба аллеля могут быть порезаны. Наиболее же эффективным Cas9 был в распространении целых генетических кассет.

Дополнительно ученые выяснили несколько интересных фактов о никазах. Например, они обнаружили, что репарация после воздействия D10A происходит гораздо позже, чем после классической нуклеазы Cas9. Об этом свидетельствует паттерн красных пятен на глазах дрозофилы: в случае однонитевого разрыва он представляет собой многочисленные маленькие островки, а в случае двойного — несколько больших кластеров.

Более того, активная транскрипция увеличивает вероятность распространения аллеля после однонитевого разрыва. С помощью секвенирования по Сенгеру, ученые оценили эффективность распространения аллеля в нескольких органах дрозофилы. В мальпигиевых сосудах, где локус white начинает экспрессироваться уже на личиночной стадии, репарация и конверсия аллели происходила чаще, чем в органах с минимальной транскрипцией этого гена.

Таким образом, ученые нашли новые эндонуклеазы, которые можно использовать для аллельного драйва. В отличие от привычного Cas9, белки D10A и H840А вносят однонитевой разрыв в ДНК. Такой подход позволяет увеличить конверсию аллеля в два–три раза, при этом новые белки способствуют распространению аллеля даже в отсутствие нечувствительного к нуклеазе участка.