Новый редактор оснований эффективно работает в клинически значимых локусах

С помощью опосредованной фагами эволюции американские исследователи получили новый белок-редактор аденина — ABE8e. ABE8e гораздо эффективнее, чем его предшественник ABE7.10, и способен исправлять точечные мутации в недоступных ранее локусах.

Credit:
Kim Christensen | Shutterstock.com

Поскольку большая часть генетических заболеваний человека обусловлена точечными мутациями, одним из подходов к их лечению может быть прицельное редактирование мутировавшего азотистого основания. Аденин, появившийся в неправильном месте, с помощью белков-редакторов аденина (adenine base editors, ABE) можно превратить в гуанин. ABE — это гибридные белки, состоящие из домена, модифицирующего ДНК, и каталитически неактивной нуклеазы Cas9. Последняя необходима для доставки ABE к нуклеотиду. Однако в тех случаях, когда предпочтителен белок Cas, отличный от Cas9 (например, Cas12, также применяющийся в редактировании геномов), ABE часто не могут эффективно функционировать с ним в паре. Более того, многие ABE имеют довольно низкую активность, и некоторые участки генома оказываются для них недоступны.

Чтобы преодолеть перечисленные ограничения, группы американских ученых под руководством Дженнифер Дудны и Дэвида Лю создала новый ABE, ABE8e, на основе белка ABE7.10 — эффективного редактора оснований, полученного командой Лю в 2017 году. Для улучшения ABE7.10 использовали подход, известный как опосредуемая фагами эволюция (phage assisted evolution). На PCR.news ранее было приведено детальное описание подхода. В одном объеме среды обитают бактериофаги M13, кодирующие нужные белки, и хозяева фага — клетки E. coli. Фаги несут ген эволюционирующего белка (в данном случае — ABE7.10) вместо гена III, который необходим для инфицирования кишечной палочки; без продукта гена III фаг не может покинуть клетку. Этот ген перенесен во вспомогательную плазмиду, которая содержится в клетке-хозяине. И самое главное — экспрессия гена III зависит от активности эволюционирующего белка. В данном случае, чем лучше происходит замена основания, тем активнее размножается фаг. Кроме того, в бактериальных клетках содержится плазмида с набором генов, способствующих мутагенезу в ДНК фага.

В результате в последовательность дезаминазного центра ABE7.10 было внесено восемь дополнительных мутаций. Эксперименты на человеческих клетках HEK293T показали, что получившийся в результате белок ABE8e по активности в 590 раз превосходит белок ABE7.10, на основе которого он был создан. Более того, он прекрасно работает в паре с разнообразными вариантами Cas9 и Cas12. Наконец, исследователи показали, что ABE8e способен вносить точечные мутации в промоторную область или в соответствующий энхансер гемоглобинового локуса, повышающие экспрессию фетального гемоглобина. При этом эффективность редактирования этих сайтов с помощью ABE8e в несколько раз выше, чем при использовании ABE7.10. Таким образом, ABE8e значительно расширяет область применения редакторов оснований.

Источник

Richter, M. F., et al. // Phage-assisted evolution of an adenine base editor with improved Cas domain compatibility and activity. // Nature Biotechnology (2020), published online 16 March 2020; DOI: 10.1038/s41587-020-0453-z
Добавить в избранное

Вам будет интересно